原花青素影响成骨细胞中NF-κB及细胞因子的变化

●孟杰刘刚吕国平

原花青素影响成骨细胞中NF-κB及细胞因子的变化

●孟杰1刘刚2吕国平1

本研究拟观察原花青素对成骨细胞中细胞因子的影响。方法：培养成骨样细胞MC3T3，与原花青素共孵育后，收集细胞，加入细胞裂解液提取细胞中总蛋白，Trail法提取总mRNA，分别通过Western blot 和RT-PCR方法，观察细胞因子以及NF-κB表达水平的变化。结果：与对照组相比，ELISA结果提示，原花青素应用后，细胞因子IL-10、IL-6、和IL-13的含量显著降低（P＜ 0.01），同时体现剂量依赖性。RT-PCR和免疫蛋白印迹结果表明，与空白对照组相比，原花青素可以显著降低MC3T3细胞中NF-κB的表达（P＜ 0.01）。结论：原花青素可以降低成骨细胞中细胞因子及NF-κB的表达水平。

成骨细胞；原花青素；NF-κB; IL-6

成骨细胞是骨代谢的主要功能细胞，调节破骨细胞对骨的吸收，决定骨的形成[1]。在骨吸收时，白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）起到了重要的作用，成骨细胞可以合成分泌IL-6。细胞因子如IL-1等能刺激或增加成骨细胞产生IL-6，诱导骨吸收和破骨细胞样细胞的形成[2-3]。本研究拟以原花青素为研究对象，通过培养成骨样细胞MC3T3，利用分子生物学手段，从蛋白和基因水平观察成骨细胞中细胞因子和NF-κB的变化，探讨原花青素影响成骨细胞生物活性的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

原花青素购自中国药品生物制品检定所，纯度＞98%；NF-κB抗体购自sigma公司；成骨样细胞MC3T3细胞株购自中国医学科学院基础所细胞库；MEM培养基及胎牛血清购自美国Hyclone公司；dNTP和TagDNA聚合酶购自Promega公司。

1.2 细胞培养

MC3T3细胞，接种于细胞培养板（2×105），MEM培养基（含10%灭活胎牛血清），置37℃，5%CO2孵箱内培养。分为原花青素处理组（5mol/L，20 mol/L）和对照组。

1.3 ELISA检测细胞因子的变化

按照上述分组，收集各组对数生长期的MC3T3细胞上清，ELISA试剂盒(上海凯博)测定IL-10、IL-6、和IL-13的含量。

1.4 NF-κB蛋白表达

按照上述分组，收集各组细胞，加入1ml胞裂解缓冲液，12000转/分钟，离心30分钟，收集上清。Bradford 法蛋白定量，缓冲液稀释蛋白样品，经SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入NF-κB抗体孵育（1:1000稀释），4℃过夜，再加入二抗（辣根酶标记，1：500）, 室温条件，振荡1小时，ECL发光试剂盒发光显影，Bio-Rad图像软件分析图像间的差异，计算灰度值，分析各组间差异。

1.5 NF-κB mRNA表达

按照上述分组，取对数生长期的细胞，Tzail (Invitrogen公司)法提取细胞总RNA，RT-PCR 分析NF-κB mRNA表达的变化。NF-κB 基因引物：5'-TCAATGGCTACACAGGAC CA-3'；反义5'-CACTGTCACCTGGAAC-CAGA -3'。β- actin 序列：5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3'；反义5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'。使用逆转录试剂盒（Promega公司）合成cDNA模板。反应体系为90℃，2min；94℃，2min；60℃，1min；72℃，1min；30cycles；60℃，2min。PCR产物5 ul，加1 ul的loading buffer混匀，加入样品孔内；接通电源，DNA样品由负极往正极泳动，电压为5V/cm，1%琼脂糖凝胶电泳分离30min，终止电泳。0.5%溴化乙锭（EB）染色后，凝胶成像仪观察图像，β- actin作内参考照，分析各组间mRNA表达水平的差异。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 细胞因子水平变化

与空白对照组相比，原花青素（5mol/L）可以降低细胞因子的水平（P＜0.05），而原花青素（20mol/L）能够显著降低细胞因子的水平（P＜ 0.01）。

2.2 NF-κB mRNA表达变化

RT-PCR结果表明，原花青素（5mol/L）可以降低细胞中NF-κB mRNA表达水平（P＜0.05）；经20mol/L原花青素处理后，NF-κB mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）。

2.3 NF-κB蛋白表达变化

Western blot结果也表明同样的趋势, 如图3所示，原花青素（5mol/L）可以降低细胞中NF-κB 蛋白表达水平（P＜0.05）；经20mol/L原花青素处理后，NF-κB 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。

3 讨论

原花青素是一类天然多酚类化合物，具有很强的抗氧化活性。研究证实，原花青素可以有效地清除自由基，抑制氧自由基的产生，进而减少IκB的降解，同时下调iNOS的表达，最终可以抑制缺血再灌注后的炎症反应。原花青素结构中的羟基位点，可与雌激素受体(ER)相结合，增强甲状腺释放激素的作用，从而抑制骨的吸收，促进骨的形成[13-14]。

本试验中，通过不同浓度的原花青素与MC3T3细胞孵育后，通过Western blot 和RT-PCR方法，观察细胞因子以及NF-κB表达水平的变化。ELISA结果提示，原花青素应用后，细胞因子IL-10、IL-6、和IL-13的含量显著降低，同时体现剂量依赖性。RT-PCR和免疫蛋白印迹结果表明，与空白对照组相比，原花青素可以显著降低MC3T3细胞中NF-κB的表达。提示原花青素可能通过调控成骨细胞中NF-κB通路，影响细胞因子的表达，改变成骨细胞的生物学活性，发挥进一步的生物效应。本研究将为原花青素的进一步研究和应用提供理论基础和实验依据。

（作者单位：1解放军理工大学门诊部；2南京军区总医院骨科）

[1] Gallagher JC. Advances in bone biology and new treatments for bone loss. Maturitas. 2008,20;60(1):65-9.

[2] Kwan Tat S, Padrines M, Théoleyre S. IL-6, RANKL, TNF-alpha/IL-1: interrelations in bone resorption pathophysiology. Cytokine Growth Factor Rev. 2004;15(1):49-60.

[3] Roodman GD. Treatment strategies for bone disease. Bone Marrow Transplant. 2007;40(12):1139-46.

[4] Voehringer D. Basophil modulation by cytokine instruction. Eur J Immunol. 2012;42(10):2544-50.