抗菌肽的研究进展及其应用

车媛媛查向东劳泰财赵大伟

（1.广东希普生物科技股份有限公司，广东 广州510000;2.安徽大学，安徽合肥230000）

抗菌肽的研究进展及其应用

车媛媛1查向东2劳泰财1赵大伟1

（1.广东希普生物科技股份有限公司，广东 广州510000;2.安徽大学，安徽合肥230000）

抗菌肽又称抗微生物肽，是生物体先天免疫的重要组成成分，具有广谱的抗菌作用，是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质。由于抗菌肽对细菌、真菌、原虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用，无致耐药性。随着病原微生物对抗生素的耐药性日益加剧，使得抗菌肽在医药行业和饲料添加剂等领域有良好的应用前景。本文综合近年来抗菌肽的研究，概述了抗菌肽的来源、功能、作用机制和在畜牧业上的应用前景。

抗菌肽；来源；生物活性；应用

抗菌肽 (Antibacterial Peptide)又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides)，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫，抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。由于抗生素的广泛使用导致了微生物耐药性，新型抗菌药物研发成为近年研究热点，而抗菌肽是生物天然免疫重要的效应分子，具有调节宿主免疫的作用，所以有极大的临床应用潜力。目前已有2200多种的抗菌肽，来源有细菌、真菌、人体、昆虫等，其中有些抗菌肽的基因序列已得到测定。抗菌肽具有多种优点，如无毒副作用（仅少数种类具有溶血活性）、无污染、无残留，难以产生耐药性，能抑制癌细胞扩增，调节机体免疫反应、抗炎功能，已经成为近些年来生物学及药学领域研究的热点。

1 抗菌肽的来源

1.1 来源于昆虫的抗菌肽

昆虫家族抗菌肽的一个典型例子就是天蚕素（cecropins），包括天蚕素A、B、C、D、E5种结构。天蚕素具有广谱抗菌活性，其作用机理是天蚕素抗菌肽分子可以在细菌细胞膜上穿孔后形成离子孔道，造成细菌细胞膜结构破坏而发挥抑菌作用。它们的分子中不含半胱氨酸，呈线性α-螺旋结构，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强活性，并且所有昆虫抗菌肽的C端都被酰胺化，这一性质对其广谱抗菌性极为重要。

昆虫抗菌肽的另一大家族是昆虫防御素(insect defensins)。所有昆虫防御素均带一个净的正电荷，都含有6个Cys并形成3个分子内二硫键，呈反平行β-折叠结构。昆虫防御素对革兰氏阴性菌的抗菌活性较弱，且对真核细胞和真菌不起作用，但可以抗革兰氏阳性菌。

除以上两种，还有多种昆虫抗菌肽，如来自蜜蜂的apidaecin和abaecin，来自天蚕H.cecropia的attacin A-F，来自家蚕B.mori的moricin。

1.2 来源于植物的抗菌肽

自第一种植物抗菌肽（Triticumaestivum）从禾本科植物小麦中被分离出以来，至今已有多种有活性的植物抗菌肽被发现并鉴定，除了硫堇蛋白( Thionins)，还有环蛋白、富含甘氨酸的蛋白、snakins和hevein状蛋白。硫堇蛋白是一类分子量约5kD、氨基酸残基数45～47、富含半胱氨酸的碱性蛋白。近来研究表明，硫堇蛋白能抑制多种病原细菌（如革兰氏阳性和革兰氏阴性菌）及真菌的生长。

目前关于防御素的研究是最多的，细胞防御素（Defensin）对许多种细菌有抑制作用，尤其能抑制病原体的增殖。不同种类的植物防御素的一级结构呈多样性，氨基酸组成相差较大，高含量的Cys形成稳定的二硫键，可能与其生物学特异性功能相关。然而某些抗菌肽，如椰汁中以及石榴种子中富含甘氨酸的肽，只有多个正电荷不含二硫键。目前，已分离的大多数植物防御素都有抗真菌或抗病毒特性，如NP-1可在几分钟内以低剂量浓度杀灭真菌C.albicans。

1.3 来源于动物的抗菌肽

抗菌肽起初是在无脊椎动物中发现的，随后在脊椎动物中也有发现，这些肽显示出多样的序列结构和特异性的靶标。基因编码的抗菌肽能够在哺乳动物、两栖动物、鱼类、昆虫等多种不同生物体的组织中表达。根据结构与生物学功能将动物抗菌肽分为防御素和cathelicidins。防御素含3～4对分子内二硫键，已经从不同物种中分离出了80多种防御素：包括α-防御素、β-防御素和θ-防御素。从猪小肠中纯化的抗菌肽NK-lysin，含有78个氨基酸残基，其分子量为8924 Da，对大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、化脓链状菌、NK-敏感型小鼠肿瘤细胞YAC-1有显著裂解活性。Cathelicidins是一类高效杀死细菌和真菌、具有广抗菌谱的抗菌肽。防御素和cathelicidins通过抵挡致病菌入侵而为宿主提供了第一道防线，其中一些多肽对未分化的淋巴细胞、树突状细胞有趋化性，另外还可以诱导细胞因子生成、肥大细胞脱粒等。

1.4 来源于微生物基因工程的抗菌肽

利用基因工程重组技术异源表达系统来生产抗菌肽是一种新模式，其中，大肠杆菌是生产抗菌肽良好的表达系统，但是这种表达系统可能会表达异源成分的毒性而对宿主本身造成侵害，导致表达水平低下。利用甲基毕赤酵母表达系统生产异源性的蛋白质，采用补料高密度培养方法，湿菌体浓度高达25%以上，异源蛋白分泌在细胞外，有良好的表达效果，发酵液的后处理比较容易。

1.5 来源于人工合成的抗菌肽

近年来，随着人们对抗菌肽研究的深入，科研人员尝试人工合成抗菌肽，并在医疗应用方面取得了一定的成果。利用抗菌肽研制的药物已进入市场，如：美国马盖宁制药公司研发出来的马盖宁( magainin)药物可杀死病毒和肿瘤细胞，柞蚕抗菌肽能够抑制乙型肝炎和杀灭肿瘤细胞，在医药上已制成肾肝宁胶囊治疗肾炎及肝炎等。Sang等（2007）化学合成了一种新的抗菌肽cathelicidin（K9CATH），含172个氨基酸残基，合成的抗菌肽具有广泛的抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母的活性。

2 抗菌肽的生物活性

2.1 抗细菌活性

大量研究表明，抗菌肽具有广谱的抗细菌活性，能够抑制或杀灭多种革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌。但不同抗菌肽的抗菌活性存在较大差异，抗菌谱亦明显不同。如家蚕抗菌肽的7大家族：cecropins、moricins、attacins、lebocins、enbocins、gloverins及defensins，每个家族中的抗菌肽抗菌活性和抗菌谱均不相同。

2.2 抗病毒活性

很多抗菌肽具有抗病毒活性，这些病毒都拥有膜结构。目前研究表明，抗菌肽主要通过3种机制发挥抗病毒作用。第一种是与病毒的包膜结合而起作用，如α-防御素对疱疹病毒的作用，美洲鲎素对人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)病毒的作用；第二种是抑制病毒繁殖，如天蚕素A和蜂毒素在亚毒性浓度下可以通过阻遏基因的表达来抑制HIV-1病毒增殖；第三种是干扰病毒的组装，如蜂毒素被当作病毒包被蛋白，被病毒RNA结合后，导致RNA结构改变，不能和正常蛋白质结合，从而病毒无法正常组装。

2.3 抗真菌活性

许多抗菌肽具有良好的抗真菌作用，Mg2+、Ca2+及温度均会影响其抗真菌能力。用天蚕素A和蜂毒素分子的基因片段，合成杂合肽CA-ME。杂合肽可使真菌孢子原生质体的细胞壁无法恢复，无法维持细胞的正常形态，杂合肽使细胞膜形成孔洞从而达到杀菌目的。人和灵长类动物唾液的组蛋白亦有抗真菌活性，它与细胞的包膜受体结合后进入细胞内并定位于线粒体。

2.4 抗寄生虫和原虫活性

抗菌肽对寄生虫、原虫等具有杀伤作用，可以有效地杀灭寄生于人类或动物体内的寄生虫和原虫，如疟原虫孢子、变形虫和四膜虫等。抗菌肽的靶标是寄生虫的质膜，间接引起细胞内结构和细胞器的改变，干扰细胞正常代谢。Cecropins的类似物shiva-1和蛙皮抗菌肽蛙素可以有效杀死疟原虫，蛔虫体内的抗菌肽可杀灭利什曼鞭毛虫，柞蚕抗菌肽cecropins D对引导毛滴虫亦有很好的杀伤作用。

2.5 抗肿瘤活性

抗菌肽对肿瘤细胞有广谱的杀灭作用，肿瘤细胞外膜含有较高的酸性磷脂成分，细胞骨架系统不完善，肿瘤细胞相对于正常细胞对抗菌肽的敏感度高。蜂毒素、天蚕素A、爪蛙素和α-防御素-1/2对癌细胞具有选择性杀伤作用。Mai等发现,抗菌肽DP1可以迅速诱导肿瘤细胞凋亡。

3 抗菌肽的抑菌机理

近来研究表明：抗菌活性不依赖于具体的氨基酸序列或具体的抗菌肽的结构，而是由某一种肽的氨基酸组成及其自身的理化性质决定的，众多抗菌肽的作用机制可能有助于解释其广谱抗菌活性及罕见的诱导抗性。从目前的研究成果来看，许多研究认为抗菌肽作用在细菌细胞质膜上形成孔，破坏其细胞质膜结构，导致胞内水溶性物质大量渗出，最终导致细菌死亡。另一部分研究认为，抗菌肽分子作用于细胞内物质，阻碍蛋白质和DNA的合成，破坏蛋白质的空间结构，阻止其行使正常的生物学功能。多数人倾向于第一种解释。

对于抗菌肽分子作用在细胞质膜是如何形成孔道，认为有以下三种模型。

3.1 桶-板模型（Barrel-stave model）

该模型认为抗菌肽分子插在细胞膜内，垂直排列形成木桶侧板状孔道，其疏水基团与磷脂膜相互作用，亲水基团面向内部形成一个桶状的离子通道，胞内物质外泄导致细胞死亡。一般认为，阳离子抗菌肽能够形成这种离子通道，这些抗菌肽多含有α-螺旋和（或）β-折叠结构。当抗菌肽以单体形式存在时，在低浓度下相互识别，待浓度达到临界值时，慢慢形成多聚体，最终形成桶-板结构。

图1 抗菌肽的抗菌机制模型

3.2 环孔模型（Tordial-pore model）

与桶-板模型不同，这种模型中抗菌肽垂直插入细胞膜，形成亲水孔道，引入水分子，从而使脂质分子的排列方向发生改变。肽分子亲水基团与磷脂分子的亲水部分相结合，疏水基团面向脂质核心，以螺旋环状在细胞膜内形成连续环形孔道。

3.3 地毯模型（Carpet Model）

这种模型中的抗菌肽在静电作用下与带有阴离子的磷脂头部基团相结合，不插入到细胞膜内而是与脂双层表面互相平行，疏水基团面向磷脂膜、亲水面朝向溶液，类似地毯覆盖在细胞膜表面。当肽分子达到一定浓度时，会破坏细胞膜成微团状，使细胞内容物外泄，膜电势发生改变，最终导致细胞死亡。

4 抗菌肽在畜牧业中的应用

4.1 作为饲料添加剂应用

应用基因工程手段大量生产抗菌肽，并将其作为饲料添加剂可以使饲养动物对外源致病菌具有更好的抵抗力。抗菌肽具有良好的加工特性，能耐100℃高温、适宜pH2.5～9、贮藏稳定性高、配伍协助性高等。在发酵结束后进行高温浓缩处理时，工程菌菌体被充分杀灭而抗菌肽本身却不会失活。抗菌肽具有独特的杀菌机制，病原菌不易对其产生耐药性。因此，畜牧行业中，抗菌肽作为饲料添加剂是目前饲料工业发展的一个新的研究方向。但目前在实际生产中的应用鲜有报道，只有少数相关试验研究。温刘发等（2001）用甲醇诱导启动子AXO1成功表达抗菌肽基因，并分泌到菌体外，经过发酵条件的优化获得的抗菌肽活力达5600 U/mL。这些酵母发酵液以饮用水摄入计量为60U/（只·天）的粤黄鸡饲养试验。结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量。侯振平等（2011）、Tang等（2009）、潘行正等（2010）发现，在仔猪饲粮中添加抗菌肽能够增加肠道益生菌数量，控制腹泻率，提高仔猪生长性能，从而提高成活率。

4.2 提高动物生产性能

饲料中添加适量的抗菌肽，能够使饲料的利用率提高，进而促进动物的生长。陈香等（2011）通过对断奶仔猪基础日粮中添加天蚕素代替抗生素，对仔猪的生长性能和饲料转化率等进行了比较，结果表明天蚕素对仔猪生长性能有一定的促进作用，并且能显著改善饲料转化率，降低饲料成本。关静姝等（2015）在1日龄健康肉鸡日粮中添加肠杆菌肽抗菌肽300 mg·kg-1，结果发现，与不饲喂抗菌肽的对照组相比，饲喂抗菌肽肉鸡出栏体重和平均日增重均增加，死亡率降低69%，同时也提高饲料的转化率，改善动物的生产性能。张江（2015）等利用微生态制剂与天蚕素抗菌肽复合产品饲喂奶牛，试验发现，基础日粮中添加微生态和抗菌肽复合制剂，可提高奶牛平均产奶量1.5kg，体细胞降幅达60%。陈晓生等（2005）于肉鸭日粮中添加液体的蚕抗菌肽AD-酵母制剂发现，血清代谢激素的活动显著增强，IGF-1浓度升高，营养物质合成加强；甲状腺素T3升高，脂肪、T4降低；尿素氮浓度显著降低，体内氮排出减少。

4.3 提高动物抗病能力

在抗菌肽作用机理的基础研究中人们观察到其对机体免疫功能产生的重要作用，而进一步的研究发现，抗菌肽作为饲料添加剂也可以提高动物的免疫能力。利用抗菌肽的抗菌、杀菌作用，在饲料中添加抗菌肽可以提高动物的免疫力和抗病能力。Marel等（2012）研究表明，在饲料中添加β-葡聚糖可以显著提高鲤鱼皮肤中β防御素1和β防御素2及鳃中β防御素的表达量，说明β-葡聚糖可能是通过影响鲤鱼黏膜系统来提高抗菌肽基因表达，从而提高鲤鱼的免疫力。

5 结语

随着基因工程技术的发展，对抗菌肽的研究也越来越深入。一是在分子水平上研究抗菌肽在动物免疫防御系统中的合成过程及其调控机制，二是探讨抗菌肽的药用开发价值。抗菌肽具有广谱的抗菌作用，具有促生长和治疗疾病的功能，不会产生耐药性，具有安全、无毒副作用的生物学特性，可作为一种绿色饲料产品。利用微生物大规模、高效生产抗菌肽，并且应用到动物生产中，不仅能为养殖业带来一定的经济效益，而且还保障了动物源性食品安全，促进养殖业向绿色无公害方向发展。

（略）

S816.7

A

1005-8613（2016）12-0034-04

2016-9-26