对乙酰氨基酚肝损伤时炎性因子、趋化因子以及Toll样受体表达的动态变化

金宇霆 李大伟 明雅南 张江 张明 夏强



对乙酰氨基酚肝损伤时炎性因子、趋化因子以及Toll样受体表达的动态变化

金宇霆 李大伟 明雅南 张江 张明 夏强

【摘要】目的 研究对乙酰氨基酚（APAP）引起肝脏组织损伤过程中的炎性因子、趋化因子以及Toll样受体的动态变化。方法 随机将30只小鼠分为6组：对照组、APAP1 h组、APAP3 h组、APAP6 h组、APAP12 h组，APAP24 h组，每组5只。禁食15 h后，对照组小鼠腹腔注射0.9％氯化钠溶液，其余5组腹腔注射APAP300 Mg/kg诱发小鼠肝损伤。取各组小鼠肝脏组织采用实时PCR检测炎性因子、趋化因子以及Toll样受体的MRNA水平，HE染色观察各组肝脏组织损伤情况。结果 与正常对照组相比，24 h内APAP诱发的小鼠肝损伤随时间推移加重。IL-6、IL-10、IL-1β、IP-10 MRNA相对于对照组在不同时间点有不同程度升高；MIP-3α 24 h相较对照组明显下降（P＜0.05）；IFN-γ和TNF-α各时间点变化差异无统计学意义。趋化因CXCR-2和CCR-2在24 h与对照组比较明显下降（P＜0.05）；CXCL-2分别在12 h 和24 h升高14.8倍（P＜0.05）和7.8倍（P＜0.05）。Toll样受体TLR-9、TLR-4相对对照组在不同时间点亦有不同程度升高或降低。结论 对乙酰氨基酚诱导肝损伤后，肝组织炎性因子、趋化因子及Toll样受体MRNA表达水平发生明显改变。

【关键词】对乙酰氨基酚；炎症因子；趋化因子；Toll样受体

治疗剂量的对乙酰氨基酚（APAP）是一种安全有效的止痛和退烧药物。但是，过量使用APAP能导致以肝小叶中央纤维化为特点的急性肝衰竭。近几十年来，APAP引起的急性肝损伤已经成为急性肝衰竭的主要原因［1］。APAP在肝细胞内经过CYP450代谢转化成N-乙酰-对苯醌亚胺（N-acetyl-p-benzoquinone Imine，NAPQI）。NAPQI可与胞内亲核物质结合进入细胞核，产生肝细胞毒性［2］。正常情况下NAPQI通过结合谷胱甘肽解毒，所以谷胱甘肽耗竭在肝脏损伤进展过程发挥重要的作用。有学者认为，APAP诱导急性肝损伤的病理生理过程主要是代谢产物激活、谷胱甘肽消耗和蛋白结合［3］。APAP肝损伤与肝细胞线粒体功能障碍，自由基代谢产物增加以及氧化应激等有密切关联［4］。近年的研究发现，固有免疫应答和炎性反应在APAP诱导的肝损伤也起重要作用［5］。本研究观察APAP诱导的肝损伤小鼠模型病理生理过程中炎性因子、趋化因子及Toll样受体的动态变化，为进一步理解APAP肝损伤机制提供科学依据。

资料和方法

一、实验动物与主要试剂及仪器

（一）实验动物 雄性C57BL/6小鼠，鼠龄8～10周，体质量20～25 g，无固定病原体级（SPF），购自中国科学院上海实验动物中心。小鼠均于清洁环境下昼夜规律喂养，自由进食、饮水。

（二）试剂及仪器 APAP购自美国Sig ma公司；TLR-9、TLR-4、CXCL-2、CXCR-2、MIP-3a、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、CCR-2、IL-6、IL-10、IP-10引物购自日本Ta KaRa公司；SYBR购自日本Ta KaRa公司；TRIZOL购自美国Invitrogen公司；徕卡显微镜购自德国徕卡仪器有限公司；Minispin台式高速离心机购自德国Eppendorf公司；苏木素伊红（HE）染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所；微量加样器购自德国Eppendorf公司。

二、动物分组及模型的制备

采用随机数表法将30只小鼠，每组5只，分为6组：对照组、APAP1 h组、APAP3 h组、APAP6 h组、APAP12 h组，APAP24 h组。所有小鼠注射APAP溶液之前禁食15 h。实验组小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚溶液300 Mg/kg，对照组小鼠腹腔注射0.9％氯化钠溶液，注射对乙酰氨基酚溶液后恢复正常食物供应。

三、检测指标

（一）小鼠肝脏炎性因子、趋化因子和Toll样受体MRNA肝脏RNA提取及实时定量（qRT）PCR分析MRNA表达水平。总RNA根据制造商提供的步骤用Trizol（购自美国Invitrogen）法提取。所提取的总RNA用分离光度计测定RNA在260 nm处的吸光度，以A260 nm/A280 nm评估提取的总RNA的浓度和质量。选取A260 nm/A280 nm在1.9～2.0之间的样品用于qRT-PCR分析。然后将所提RNA反转录成cDNA。qRT-PCR用20μL体系包括cDNA，SYBRGreen PCR混合液（购自日本Takara公司）水及引物（购自上海皓嘉生物公司），反应条件为95℃，酶活化15 min；95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，一共40个循环。

（二）小鼠肝组织HE染色 小鼠肝脏组织取肝左外叶和右外叶，用体积分数为0.04甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片（厚5μm），HE染色，于显微镜下观察肝组织病理改变。

四、统计学分析

采用SPSS软件（19.0版）进行统计处理，组间均数的比较采用方差分析（ANOVA）或者Kruskal-Wallis检验，并使用Dunnett t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结　果

一、APAP肝损伤组织病理形态学影响

给予APAP后不同时间点肝组织病理形态学观察结果如图1所示。随着时间推移，肝组织坏死情况逐渐加重，SUZUKI评分增高。对照组：肝小叶结构完整，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝细胞未见变性、坏死；APAP1 h组：肝小叶结构尚清楚，可见中央静脉周围少量肝细胞胞质气球样变；APAP3 h组：肝小叶结构尚可见，可见点片状坏死，肝细胞气球样变明显增加，肝窦充血可见；APAP6 h组：肝小叶结构模糊，可见较大面积细胞坏死，大量肝细胞水肿及炎性细胞浸润改变；APAP12 h组：肝小叶结构不完整，大片状细胞坏死，肝窦充血明显；APAP24 h组：肝小叶结构明显破坏，大面积细胞坏死，明显炎性细胞浸润。

二、APAP肝损伤肝组织中Toll样受体MRNA水平变化

由图2 A可见，与对照组相比，APAP300 Mg/kg诱导的肝损伤组织TLR-9 MRNA在1 h升高4.6倍（P＜0.05），之后开始下降，在3 h降到2.6倍（P＜0.05），并于6 h恢复正常水平。TLR-4（图2B）在3 h降到对照组的25％（P＜0.05），直至24 h尚未恢复正常水平。

三、APAP肝损伤肝组织中趋化因子MRNA水平变化

IP-10（图2 C）在6 h开始升高至对照组的13.5倍（P＜0.05），12 h为4.3倍（P＜0.05），并于24 h恢复正常。CXCL-2（图2 D）表达水平与对照组相比，在前6 h变化差异无统计学意义，于12 h和24 h分别升高14.8倍（P＜0.05）和7.8倍（P＜0.05）。CXCR-2（图2 E）表达水平在24 h降至对照组的39％（P＜0.05），24 h前表达变化差异无统计学意义。CCR-2（图2F）表达水平与对照组比较，3 h降到30％（P＜0.05），且3 h至24 hCCR-2表达变化程度组间比较差异无统计学意义。

四、APAP肝损伤肝组织中炎性因子MRNA水平变化

IL-6（图3 A）3 h表达水平相较于对照组升高2.6倍（P＜0.05），其他时间点变化差异无统计学意义。IL-10（图3B）跟对照组相比，在1 h、3 h、6 h分别升高2.5倍、2.4倍、2.1倍（P＜0.05），12 h恢复正常水平，24 h降至52％（P＜0.5）。由图3 C可见，IL-1β表达水平1 h升高2倍（P＜0.05），其他时间点与对照组相比差异无统计学意义。与对照组相比，MIP-3α（图3F）24 h表达水平下降至23％（P＜0.05），其他时间点差异无统计学意义。TNF-α（图3 D）与IFN-γ（图3 E）相较于对照组，在各时间点的变化皆差异无统计学意义。

讨　论

APAP诱导小鼠肝损伤与临床肝损伤病理过程极为相似，本实验通过各个时间点的肝脏HE染色来观察24 h内APAP诱导肝损伤进展情况，并采用qRT-PCR检测各时间点肝脏组织的炎性因子、趋化因子及Toll样受体MRNA表达水平的变化，以研究APAP肝损伤病理过程固有免疫所发挥的作用。

图1　对乙酰氨基酚作用不同时间对肝组织的影响

图2　Toll样受体和趋化因子MRNA相对表达量

目前认为，无菌性炎性反应和固有免疫细胞参与APAP诱导的肝损伤和修复，而相较肝脏缺血再灌注损伤、梗阻性胆汁淤积和内毒素血症的病理生理过程，炎性细胞对APAP肝毒性的作用是矛盾的。APAP肝毒性反应被认为最初是由NAPQI启动。超剂量应用APAP时，人体内葡萄糖醛酸化和硫酸盐化作用负载过重，且谷胱甘肽过度消耗，过量的NAPQI共价结合半胱氨酸家族形成APAP蛋白加合物，激活氧化应激反应，导致线粒体功能失调和DNA损伤，最后介导肝细胞坏死。谷胱甘肽和共价结合是APAP肝毒性的先决条件。然而，肝损伤的严重程度却取决于下游的炎性细胞因子释放。APAP诱导的肝细胞坏死可激活固有免疫细胞及募集炎性细胞，而固有免疫细胞释放的炎性介质，如炎性因子、趋化因子、氧自由基等，参与肝脏损伤的进展。

图3　炎性因子MRNA相对表达量

库普弗细胞是定位于肝脏的具有噬菌作用的巨噬细胞，具有多重功能，如吞噬作用、內吞作用、免疫调节作用、合成和分泌各种生物活性介质。研究表明［6］，TLR-4基因敲除的小鼠对APAP肝毒性更加敏感。本实验结果显示，TLR-4 MRNA水平在APAP腹腔注射后3 h，下降到对照组的25％，直至24 h未恢复正常。同时还发现TLR-9在1 h就开始明显升高，6 h才恢复正常水平。TLR-9可被APAP肝损伤的坏死细胞产生的DNA激活，协同Nalp3促进IL-1β生成。而IL-1β则是一种非常重要的促炎性因子，本实验中IL-1β在1 h升高了2倍，说明IL-1β参与APAP肝损伤早期的炎性反应。

有文献表明［7］，IFN-γ基因敲除小鼠对APAP肝毒性敏感性明显降低。APAP诱导肝损伤情况下库普弗细胞激活产生的TNF-α表达量升高［5，7］。然而本实验结果表明，IFN-γ和TNF-α在APAP诱导肝损伤肝组织的MRNA表达量在各时间点差异无统计学意义。IL-6和IL-10对APAP引起的肝损伤有明显的保护作用。Masubuchi等［8］研究发现，IL-6基因敲除的小鼠肝细胞内的热休克蛋白缺乏，导致机体对APAP肝毒性更加敏感。本研究结果表明，IL-6和IL-10 MRNA分别在APAP诱导肝损伤后3 h和1 h开始升高，与文献报道较为一致［9］。趋化因子募集炎性细胞，参与APAP肝脏毒性过程，MCP-1、MIP-1α、MIP-2及IP-10在应用APAP的动物模型的肝脏组织明显上调表达［10］。趋化因子对于APAP肝损伤的作用充满争议，一些学者认为趋化因子通过增强炎性细胞迁移促进肝损伤，然而也有部分研究认为趋化因子具有对抗肝损伤的作用，这类保护作用依靠浸润的炎性细胞释放抗炎细胞因子以及直接刺激肝细胞增生实现。趋化因子CCR-2，CXCR-2保护APAP肝损伤，CCR-2是MCP-1的受体，小鼠敲除CCR-2基因后，APAP肝毒性损伤加重，且与损伤相关的肝脏IFN-γ和TNF-α表达升高［11，12］。本研究结果显示，CXCL-2相对于对照组在12 h和24 h分别升高14.8倍和7.8倍，CCR-2和CXCR-2则是在各自时间点有不同程度下降。

APAP诱导肝脏毒性反应是个非常复杂的过程，多种细胞及生物活性物质参与其中。固有免疫系统对于APAP肝损伤是重要的参与者。本研究讨论了炎性因子、趋化因子和Toll样受体在APAP肝损伤病理生理过程的动态变化，证实了固有免疫系统在APAP肝损伤的重要作用，为进一步研究固有免疫与APAP肝损伤之间的联系以及阐明APAP肝损伤的具体机制提供借鉴。

参 考 文 献

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（本文编辑：钱燕）

·临床与基础研究·

Dynamic variation of inflam matory cytokines，chemokines and Toll-like receptors in APAP-induced liver injury

JINYu-ting，LIDa-wei，MINGYa-nan，ZHANGJiang，ZHANGMing，XIAQiang. Department of Liver Surgery，RenJi Hospital，ShanghaiJiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200127，China

【Abstract】Objective To explore the dynamic changes ofinflam matory cytokines，chem okines and Toll-like receptors （TLR）in acetaminophen（APAP）-induced liver injury within 24 hours. Methods C57BL/6 mice were rando mly divided into six groups：control group，APAP1h group，APAP3h group，APAP6h group，APAP12h group and APAP24h group，including 5 mice in each group. After fasting for 15 hours，control group were given 0.9％saline by intraperitoneal injection，w hile other groups were given 300 Mg/kg APAP. Assessment of the various inflam matory cytokines，chem okines and TLRin mice liver was carried out at MRNAlevel by realtime poly merase chain reaction（RT-PCR）. Degrees of APAP-induced liver injury were evaluated by haematoxylin eosin（HE）staining. Results According to HEstaining result，APAP-induced liver injury in APAPgroups increasingly aggravated within 24 hours w hen compared with that in control group.In APAPgroups，RT-PCRindicated that MRNAlevels of IL-6，IL-10，IL-1βand IP-10 rose to various degrees at different time points，w hile MIP-3α MRNAlevels declined distinctly（P＜0.05），w hich was in contrast to control group. Additionally，variation ofinterferon（IFN）-γ and tu Mor necrosis factor（TNF）-α had no statistical difference between APAPand control groups.In APAPgroups，levels of CXCR-2 and CCR-2 were obviously lower at 24h（P＜0.05）than those in control group，w hile level of CXCL-2 rose to 14.8 and 7.8 times higher at 12h and 24h（P＜0.05），respectively. Furtherm ore，levels of TLR-9 and TLR-4 changed to various extents at different time points（P＜0.05）. Conclusion APAPfor 300 Mg/kg induces mice liver injury within 24h，w hich makes inflam matory cytokines，chem okines and TLRchange obviously at MRNAlevels in mice liver.

【Key words】Acetaminophen；Cytokine；Chem okine；Toll-like receptor

收稿日期：（2015-08-31）

Corresponding author：XIAQiang，Email：xiaqiang@medmail.com.cn

通信作者：夏强，Email：xiaqiang@med mail.com.cn

基金项目：国家自然基金项目（81472243）；上海市卫生局重点联合攻关项目（2013ZYJB001）

作者单位：200127 上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科（金宇霆，李大伟，张江，张明，夏强）；消化内科（明雅南）