轮状病毒疫苗研究进展

牟迪，夏伟，朱子健，张宇辉，朱庆虎

（1.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨150001；2.中国农业大学生物学院，北京海淀100193）

猪病防制与保健

轮状病毒疫苗研究进展

牟迪1，夏伟1，朱子健2，张宇辉1，朱庆虎1

（1.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨150001；2.中国农业大学生物学院，北京海淀100193）

轮状病毒（Rotavirus,RV）是引起多种幼龄动物以及婴幼儿腹泻的重要病原体。轮状病毒最早是Mebus在1969年从犊牛粪便中发现的，1973年澳大利亚科学家Bishop等在患有严重腹泻婴儿的十二指肠黏膜及粪便中发现了一种新的病毒粒子[1]。在非洲和亚洲的撒哈拉以南地区，据调查超过三分之一的婴幼儿腹泻及胃肠炎疾病由轮状病毒引起，每年导致50万～60万婴幼儿死亡[2-3]。欧洲和美国预防和治疗该类疾病的直接和间接医疗费用高达数10亿美元[4]。自从1974年英国Woode和Bridge首次从猪体分离出轮状病毒后，紧接着轮状病毒引起的仔猪腹泻相继被澳大利亚、北爱尔兰、美国、法国等国家报道，轮状病毒在猪中的传播开始被世界各国重视。我国首次出现猪轮状病毒（Porcine Rotavirus, PRV），是1982年阙玲玲于中国台湾发现，之后江苏、山东等地也陆续报道[5]。不同地区感染轮状病毒的普遍性说明，单纯靠提高卫生水平对轮状病毒的感染率和发病率影响不大。此外，虽然轮状病毒感染引起的临床症状可用一些药物来缓解，但暂时还没有研制出用于治疗轮状病毒感染的特效药物[6]。因而，加强对轮状病毒感染机制的研究，为预防轮状病毒感染开发安全有效的疫苗具有必要性。

1 轮状病毒的病原学特征和血清型

轮状病毒（Rotavirus,RV）属呼肠病毒科，轮状病毒属，病毒无囊膜，呈二十面体对称，直径为65～75 nm。在电子显微镜下观察，轮状病毒是带有短纤突且外缘光滑近似轮状的粒子。由外层衣壳（VP7和VP4）、中间衣壳（VP6）和内层衣壳（VP2）3部分组成病毒粒子。通常只有包裹3层衣壳蛋白的粒子才具有传染性[7]。中央为一个致密的六角形核心，直径37～40 nm，即芯髓。被内层衣壳、RNA依赖性RNA聚合酶（VP1）及修饰酶（VP3）包裹的病毒基因组，由11个不连续的dsRNA组成，编码6个结构蛋白（VP1～VP4/VP6/VP7）和6个非结构蛋白（NSP1～NSP6），除第11个节段含有两个开放阅读框并编码NSP5和NSP6外，其他每节段分别编码一种蛋白[8]。不同的轮状病毒毒株在宿主体内共感染，可能会造成11个基因节段发生重配，导致新的轮状病毒变异株的产生。

轮状病毒编码的VP6蛋白位于中间衣壳，因其具有高度保守性，常称之为群抗原或诊断抗原，根据其抗原性的不同可以将轮状病毒分为A～G 7个种群，感染人的轮状病毒大多属于A群，根据结构蛋白VP4和VP7可以把RV分成G、P两个血清型，包括24个G血清型和33个P血清型[9]，G血清型分型取决于VP7中和抗原，而P血清型分型取决于VP4血凝素抗原。目前，G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8] 5种血清型的轮状病毒是危害人类健康最为重要的毒株[10]，其中G1P[8]和G3P[8]型在我国最为常见。

2 轮状病毒感染的病理变化

RV感染后主要侵犯空肠的微绒毛上皮细胞，使其凋亡。病变细胞脱落，微绒毛变短、变钝。原位于隐窝底部拥有分泌功能的细胞取而代之。小肠功能丧失源于以上病变，水与电解质分泌增加，吸收减少，引起分解。另外小肠微绒毛上皮细胞功能出现障碍，降低双糖酶分泌，乳糖起不到被消化吸收的作用，在肠道内积聚从而诱发渗透性腹泻。仔猪感染轮状病毒的病变主要限于消化道，胃弛缓，内充满凝乳块和乳汁，小肠壁变薄，呈半透明状，肠内容物呈浆性或水样，灰白或灰黑色，肠系膜淋巴结水肿，胆囊肿大，肠绒毛萎缩。

起初认为，婴幼儿及动物感染轮状病毒仅限于胃肠道内，但随着深入研究得出，轮状病毒感染后不仅破坏肠道黏膜系统，同时全身多个器官可以被侵犯源于感染引发的病毒血症，更可导致感染幼龄动物死亡的后果。RV易感的肠外器官与组织主要有支气管与肺泡、心、肝、肾、胰、胆等。Gilger等研究表明，婴儿时期的肝脏损害与轮状病毒感染有紧密关联。此外，感染轮状病毒后，根据肝组织内RV-RNA强阳性染色较密集的分布，结合肝细胞浊肿及明显脂肪病变等病理改变，提示轮状病毒拥有嗜肝组织的能力。姚英民等在一例RV感染患儿的脑脊液、腹水和肺组织中均检出RV，病理改变除典型RV胃肠炎外，以肺脑病理改变为著称，可见水肿、瘀血、出血、大量组织和淋巴细胞浸润[11]。任小梅等报道276例患儿中69例患儿在腹泻的同时合并有呼吸道感染，其中上呼吸道感染、支气管炎和支气管肺炎均有发生，通过胸片检查可以看出肺纹理增粗，小斑片或条索状阴影[12]。

3 轮状病毒检测方法

3.1 抗原检测

分离培养是轮状病毒病原检测的经典方法。1980年Wyatt等建立了人轮状病毒Wa株分离培养技术检测方法，将毒株在无菌仔猪中连续传代11代后转接到非洲猕猴肾细胞中培养获得成功[13]。2012年库旭钢等采集腹泻仔猪粪便后接种于MA-104细胞，分离鉴定后判定为RV[14]。由于分离病毒对培养条件要求高，分离时间较长，且操作过程繁琐，耗费较多，不适于在基层推广应用。免疫荧光技术检测轮状病毒是把发病早期的空肠或内容物制成压片，用轮状病毒荧光抗体染色，可通过镜下观察肠绒毛上皮的胞浆区域是否检测到荧光。

在分子生物学检测方法中，RT-PCR是目前应用最多的快速诊断方法，具有操作简单、诊断快速、敏感性和特异性高等特点。2006年Song等应用多重RT-PCR方法检测157份仔猪临床腹泻病料，其中RV的阳性率为13.2%[15]。随着分子生物学技术的不断发展，荧光定量RT-PCR技术在RV的诊断上也得到了应用。通过与普通RT-PCR方法进行对比分析后发现，荧光定量RT-PCR的灵敏度比普通的RT-PCR敏感性要高100倍。荧光定量RT-PCR检测技术灵敏度与特异性都比较高，可对样品进行快速、大量检测。环介导等温扩增技术能在60～65℃情况下，经过具备链置换特征的Bst DNA聚合酶实现靶序列的扩增，只需要固定温度条件就能扩增出目的核酸片段，经过Screen GreenⅠ染色或者离心沉淀观测结果，与常规RT-PCR相比，可以省略模板的热变性、温度的循环、电泳条带及紫外线灯观测等一系列过程。基于核酸序列的扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）是RNA体外扩增技术的一种，可以理解为RNA-PCR。寇晓霞等研究显示，NASBA能检出最高核酸水平为50 pg，RT-PCR能检测出最高核酸水平为100 pg[16]。若标本中含有靶细菌和病毒时，NASBA-ELISA系统就会产生非特异性信号。经过研究进一步证实，利用该系统检测快速、简便，具有灵敏度高、特异性强的优点。

3.2 抗体检测

ELISA检测方法的优点在于它的操作过程比较简单、便捷，重复性比较高，高通量、价格低等。1985年，ELISA被WHO（世界卫生组织）推荐为人类轮状病毒（HRV）的检测方法。目前，广泛应用于RV检测的是双抗体夹心ELISA法，可根据检测目的的不同设计包被抗体与检测抗体。相对于过去采用的高效价抗血清和多克隆抗体，单克隆抗体技术不仅克服了体外培养病毒的限制，减少了对高效价免疫血清的需求，提高了特异性及灵敏度，还可以进行血清分型和毒株鉴别，适用于临床大规模检测和流行病学调查。Zhu等以原核表达的RV VP7蛋白作为诊断抗原，建立了检测RV抗体的间接ELISA方法[17]。Barman等对位于印度Assam地区的528份猪血清样品进行了间接ELISA检测，其中RV阳性率占51.1%，高于猪传染性胃肠炎病毒（39.4%）和猪流行性腹泻病毒（21.2%），约13.6%的猪只血清样品中含有以上3种病毒的抗体[18]。

乳胶凝集试验检测轮状病毒具备很多优点，如操作简便、检测时间短、对试验仪器要求不高等。对检测结果的判定只需2～3 min，可进行快速筛查，是适合应用于基层检疫部门的检测方法，但如果采集了含有较多油脂或其他悬浮物的腹泻样品，不能彻底离心，就会形成影响检测的非特异性凝集物，造成结果不准确。有国外的试验显示，乳胶凝集试验检测粪便样品的灵敏度为87%，特异性为73%～80%[19]。胶体金免疫技术无需特殊仪器，无污染，价格低廉，结果直观，是目前检测轮状病毒最简便、最快速的方法。研究显示，将胶体金颗粒用轮状病毒结构蛋白VP6单克隆抗体标记，选用RV多克隆抗体作为检测线，羊抗鼠IgG作为质控线，成功地制备了检测轮状病毒的胶体金试纸条[20]。

4 轮状病毒疫苗的研究进展

4.1 人轮状病毒疫苗

作为威胁人类和动物健康的第二大腹泻疾病，轮状病毒成为引起全世界人类和动物严重腹泻和脱水的主要诱因。发展中国家与发达国家在轮状病毒感染方面具有类似情况，轮状病毒腹泻的发病率不会随着公共卫生条件的改善而减少。营养状况对发病危险的重要性也远低于细菌性腹泻。另外，流行病学的研究表明自然感染轮状病毒后，随后感染的发病率和严重程度呈下降趋势。因此，预防轮状病毒感染行之有效的方法是疫苗。

目前，人轮状病毒疫苗主要以口服活疫苗为主。口服活疫苗在有效地诱导局部黏膜免疫后，能产生抗体和细胞介导的免疫反应，具有同天然感染作用途径相一致的特点。不同国家和地区单价疫苗的保护性不同，表明轮状病毒各血清型之间交叉保护性差。通过使用多价疫苗或各国各地区根据本地流行株研制的有针对性的疫苗可以预防轮状病毒。1998年美国正式批准了一种由人-恒河猴轮状病毒重配的四价疫苗（Rota shield）上市，虽然该疫苗在各地区的保护率达50%以上，但是后来流行病学协会发现该疫苗能增加部分儿童出现肠套叠的几率，从而导致该疫苗在1999年6月被停用[21]。近年来，正是传统疫苗自身存在的缺陷，使得人轮状病毒基因工程疫苗也展开研究。被看作第3代疫苗的DNA疫苗，从1992年开始作为一种新型疫苗迅速发展。国内外对轮状病毒DNA疫苗的研究都有报道。周旭等将轮状病毒G1型Wa株的VP7基因克隆到真核表达载体pCDNA3 1（+）中，经Sepharose CL4B柱层析，获得纯化的质粒，通过肌肉注射和皮下注射，免疫BALB/c及F1小鼠后，产生了抗轮状病毒Wa抗体。其中F1小鼠的抗体应答高于BALB/c小鼠，肌肉注射优于皮下注射[22]。

4.2 动物轮状病毒疫苗

灭活疫苗不存在毒力返强的危险，使用相对安全，方便运输和储存，但是由于不能保证足够的抗原含量，通常导致免疫效果不佳。史月明利用我国猪轮状病毒分离毒株JL94株制备油乳剂灭活疫苗[23]。2008年姜英等将G1、G2、G3、G4四价轮状病毒灭活疫苗免疫小鼠，能刺激机体产生针对轮状病毒的特异性IgG抗体，但IgA应答较弱，表明该四价轮状病毒灭活疫苗具备很好的免疫原性[24]。张俭伟等将牛轮状病毒（CHLY株）进行甲醛灭活，并分别制备油乳佐剂疫苗和铝胶佐剂疫苗，免疫小鼠和家兔，结果表明在小鼠和家兔体内均检测到高水平的特异性血清抗体，并且在母兔初乳仍可检测到抗体的存在[25]。

弱毒疫苗在预防猪RV感染上受到世界各国的广泛应用，轮状病毒（RV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原，往往不单由其中一种引起发病，混合感染的情况很常见，故为了达到更好预防仔猪腹泻的效果，通常与TGEV、PEDV其中1种或2种病毒一起制成联合弱毒苗。国外疫苗有美国RV弱毒苗、RV-TGEV二联弱毒苗和俄罗斯的三联弱毒苗。由哈尔滨兽医研究所研制的猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒二联冻干苗，经过多年的现地实践证明，此苗用于两种猪病毒性腹泻的预防，安全有效。此外，哈尔滨兽医研究所研制的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒三联活疫苗于2015年3月问世，填补了我国猪用RV疫苗的空白。主动免疫接种后7 d产生免疫力，免疫期为6个月。妊娠母猪于产仔前40 d后海穴位（即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位）接种，20 d后二免，仔猪被动免疫的免疫期至断奶后7 d。

对于亚单位疫苗的研究，现在已经在大肠杆菌等表达系统中成功的表达了轮状病毒不同的结构蛋白，使得不同结构蛋白的作用以及亚单位疫苗的研制成为可能。亚单位疫苗具有储存、运输等过程当中效价很稳定、无副作用等多种优点。而核酸疫苗由于兼具亚单位疫苗的安全性，以及弱毒疫苗的有效性，能同时诱导机体产生体液和细胞免疫应答，能发挥一种疫苗预防多种传染病的作用，目前还尚在研究阶段，应用于防制传染病的实践还需更深入研究。在转基因疫苗的研究中，已经有许多人类和动物蛋白基因转入到植物中表达蛋白，来获得抗原。张二芹等成功地将猪轮状病毒内壳蛋白VP6基因转化到烟草中，从而奠定制备新型猪轮状病毒转基因植物疫苗的基础[26]。

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（编辑：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)04-0089-03

2016-06-04

牟迪（1988-），男，吉林伊通人，硕士，主要从事畜用疫苗技术服务工作.E-mail：281032446@qq.com