扶肾降浊方对系膜增生性肾炎大鼠肾小管间质损害的保护作用*

苏玮莲，李国霞，宁志芬，李春雨，李经秀，魏晓露

(1.天津中医药大学，天津 300193;2.天津医科大学，天津 300070)

扶肾降浊方对系膜增生性肾炎大鼠肾小管间质损害的保护作用*

苏玮莲1，2，李国霞2△，宁志芬2，李春雨2，李经秀2，魏晓露2

(1.天津中医药大学，天津 300193;2.天津医科大学，天津 300070)

目的:观察扶肾降浊方对系膜增生性肾炎大鼠肾小管间质损害的保护作用。方法:采用系膜增生性肾炎模型，将大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、扶肾降浊方组、贝那普利组。分别观察实验16周和20周末扶肾降浊方对系膜增生性肾炎大鼠的肾功能、肾组织病理变化的影响，并设贝那普利为阳性对照组。结果:16周和20周末模型组及用药组大鼠血液肌酐、尿素氮、β2-微球蛋白和24 h尿蛋白均明显高于正常组，中药组、贝那普利组均较模型组明显降低;模型组肾小管损害明显，肾间质纤维化显著，且随造模时间延长病变程度逐渐加重，中药组和贝那普利组肾小管损害较轻，肾间质局灶性纤维化。结论:扶肾降浊方能改善系膜增生性肾炎大鼠肾功能，减轻肾小管间质损害，具有肾脏保护作用。

系膜增生性肾炎;肾小管间质损害;扶肾降浊法;保护作用

系膜增生性肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是常见的原发性肾小球疾病的病理类型。肾小管间质损害是肾小球肾炎由炎症的启动进展至肾脏纤维化的中间环节，肾小球肾炎进展至肾脏纤维化大多已不可逆转，而对其中间环节即肾小管间质损害进行早期有效的干预，则可能大大改善肾小球肾炎进展至肾功能衰竭的预后。本文采用MsPGN模型，延长造模时间至20周，使之逐渐发展成肾小管间质损害，以探讨扶肾降浊方对系膜增生性肾炎肾小管间质损害的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性Wistar大鼠48只，体质量(150±10) g，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所(实验动物许可证号 SCXK-(军)2009-003)。

1.2 药物与试剂

葡萄球菌肠毒素B(由军事医学科学院微生物流行病研究所提供，批号121101)，完全弗氏佐剂(批号 SLBC5083)和不完全弗氏佐剂 (批号SLBB9817)均购自美国 Sigma公司，牛血清白蛋白(天津润泰科技发展有限公司，AMRESCO分装，批号201410)，Masson染液(南京建成科技有限公司，批号20131018)，伊红染液(南京凯基生物科技发展有限公司产品，批号KGA231)，苏木素染液(南京凯基生物科技发展有限公司产品，批号 KGA223)，中药扶肾降浊方由山茱萸、生黄芪、白花蛇舌草、丹参、鬼箭羽、益母草组成，天津中医药大学中药学院提供，按比例称取后水煎提取经浓缩干燥制成粉末，每克粉末含生药4.06 g(批号20120810)。西药盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司，批号X1801)。

1.3 主要仪器

全自动生化分析仪，东芝 TBA-120(日本东芝TOSHIBA公司);自动脱水机Leica ASP200、包埋机Leica EG1150、切片机Leica RM2245(LEICA公司);奥林巴斯BX51显微镜成像系统(奥林巴斯公司);日本日立HT7700透射电镜。

1.4 方法

1.4.1 动物模型的建立及分组 健康雄性Wistar大鼠经普通饲料适应性饲养1周后，尿蛋白、红细胞均阴性，按随机数字表法分为正常组、模型组、扶肾降浊方组、西药贝那普利组各12只。系膜增生性肾炎模型造模方法参照刘震［1］等报道的方法加以改进。实验第1天起模型组、中药组、西药组以牛血清白蛋白20 mg配成水溶液，隔日灌胃1次，正常组以等量生理盐水隔日灌胃，直至实验结束;实验第1天模型组、中药组、西药组经皮下分点注射完全弗氏佐剂0.2ml，第8天注射不完全弗氏佐剂0.2 ml，第8天及第15天尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B (0.4 mg/kg体质量)各1次，均造模成功;正常组以等量生理盐水注射。

1.4.2 给药方法 治疗组自造模第1天开始给药，中药组以中药煎剂灌胃(51.5 g·kg－1/d)，西药组以盐酸贝那普利灌服(4 mg·kg－1/d)，模型组及正常组以等量生理盐水灌胃。实验期间，各组动物自由饮食、饮水，分别于造模第16、20周末处死动物。

1.4.3 24 h尿蛋白定量 检测16周、20周末各组大鼠24 h尿蛋白，将每只大鼠分别置于大鼠代谢笼中，留尿期间禁食，自由饮水，记录24 h尿量，用日本东芝 TBA-120全自动生化分析仪检测尿蛋白浓度，并计算24 h尿蛋白定量。

1.4.4 血液生化指标检测 分别于造模第16、20周末处死大鼠，腹主动脉取血，日本东芝TBA-120全自动生化分析仪分别检测血清中尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，Scr)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)。

1.4.5 肾组织形态学观察 分别于造模第16、20周末处死大鼠，迅速打开腹腔，将取出的两肾组织各取大小不等的两部分，一部分肾组织用4%多聚甲醛溶液固定，进行石蜡包埋切片，切片厚度为4μm，将组织切片按常规方法进行 HE、Masson染色。另一部分肾组织用2.5%戊二醛溶液固定，并按常规方法进行透射电镜观察。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，以均数±标准差(±s)表示，根据方差齐性结果选择单因素方差分析法进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血液生化指标检测结果

表1、2显示，造模16周和20周末，模型组和用药组BUN、Scr、β2-MG均比正常组大鼠增高，模型组增高明显，差异有统计学意义(P＜0.01)。随着造模时间延长，各指标值逐渐增高，肾功能逐渐损害。经中药和西药治疗后，大鼠BUN、Scr、β2-MG值均较模型组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，中西药比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠肾功能检测结果(±s)

表1 各组大鼠肾功能检测结果(±s)

注:与正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:##P＜0.01

组别 鼠数 BUN(mmol/L)Scr(μmol/L) 16周 20周 16周 20周6.56±0.55 7.05±0.44 27.80±1.04 26.66±2.54模 型 组 6 11.46±0.88＊＊ 13.00±1.30＊＊ 47.25±8.80＊＊ 55.23±5.15＊＊扶 肾 降 浊 方 组 6 8.36±0.49＊＊## 9.17±0.58＊＊## 35.63±4.05＊＊## 40.98±2.21＊＊##贝 那 普 利 组 6 8.23±0.36＊＊## 8.99±0.80＊＊## 29.96±3.09＊＊## 38.48±4.45＊＊##正常组6

表2 各组大鼠β2-MG检测结果(mg/L，±s)

表2 各组大鼠β2-MG检测结果(mg/L，±s)

注:与正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:##P＜0.01

组别 鼠数 16周 20周6 0.28±0.12 0.56±0.10模 型 组 6 0.87±0.10＊＊ 1.04±0.26＊＊扶肾降浊方组 6 0.64±0.17＊＊## 0.98±0.32＊＊##贝 那 普 利 组 6 0.61±0.06＊＊## 0.92±0.14＊＊##正常组

2.2 各组大鼠24 h尿蛋白定量结果

表3显示，造模16、20周末，模型组大鼠 24 h尿蛋白定量明显升高，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，中药组和西药组较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，尿蛋白定量随着造模时间延长显著增高;中西药比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 肾脏病理学变化

图1～3显示，普通光镜下可见正常组肾小球和肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，未发现变性和坏死，间质无纤维化及炎细胞浸润。第16周末，模型组肾小管上皮细胞出现肿胀、颗粒变性、坏死，部分小管完全萎缩。Masson染色显示，有间质纤维化伴炎细胞浸润;中药组和西药组小管轻度变性、坏死，间质有少量纤维组织增生，同时伴炎细胞浸润。第20周末，模型组小管变性、坏死程度进一步加重。Masson染色显示，肾小球和肾间质有大量纤维组织增生及大量炎细胞浸润，中药组和西药组小管变性较模型组轻，间质有局灶性纤维化及较多的炎细胞浸润。

表3 各组大鼠24 h尿蛋白检测结果(mg/dl，±s)

表3 各组大鼠24 h尿蛋白检测结果(mg/dl，±s)

注:与正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:##P＜0.01

组别 鼠数 16周 20周6 8.22± 2.28 9.14± 2.97模 型 组 6 82.56±30.50＊＊ 106.43±14.35＊＊扶肾降浊方组 6 46.76± 7.85＊＊## 70.00± 7.07＊＊##贝 那 普 利 组 6 44.56± 6.82＊＊## 71.89±10.76＊＊##正常组

图1 16周末各组肾组织HE染色病理图片(HE staining ×200)

图2 20周末各组肾组织HE染色病理图片(HE staining ×200)

图3 20周末各组肾组织Masson染色病理图片(Masson staining，×200)

图4 显示，透射电镜观察可见正常组肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜厚度正常，足突排列整齐，线粒体清晰，结构完整。第16、20周末模型组肾小管上皮细胞基底皱褶扩张，基底膜结构不完整，增厚明显，肾小球系膜细胞增多，系膜基质增多，肾间质基质和胶原纤维增多，线粒体肿胀破坏，大量溶酶体出现。中药组和西药组小鼠肾小球基底膜轻度增厚，足突融合现象不明显，肾小球系膜细胞少量增多，肾间质基质轻度增多。随着造模时间的延长，肾小管间质损害程度逐渐加重。

图4 20周末各组肾组织透射电镜病理图片

3 讨论

由慢性肾小管间质损害导致的肾间质纤维化病变已成为几乎所有肾脏疾病的共同最终结局［2］。系膜增生性肾小球肾炎以弥漫性肾小球系膜细胞增生和不同程度系膜基质增多为主要病理特征。当肾小球系膜病变较轻时，肾间质和肾小管基本正常，但是在肾小球系膜病变严重时，肾间质即可出现炎细胞浸润及纤维化，伴肾小管萎缩［3］。由此可见，肾小管间质损害系肾小球肾炎进展至肾脏纤维化的关键环节，早期防治肾小管间质损害对于防止肾小球肾炎进展恶化有重要作用。现代医学对肾小管间质损害的防治尚无特效疗法，而中医药在逆转肾小管间质损害、延缓慢性肾功能衰竭进展方面具有较好的临床疗效。李国霞［4］等研究表明，中医药对肾小管间质损害大鼠肾脏具有一定的保护作用，因此研究及开发中医药对肾小管间质损害的防治作用具有较高的价值。

根据中医理论，慢性肾小球肾炎发展到肾小管间质损害阶段，脾肾两虚(尤其是肾虚)是其发病的内在因素，湿热瘀浊是其迁延不愈的病理基础［5］。本研究前期工作表明，扶肾降浊方可抑制COLⅠ和COLⅢ在肾脏的积聚以减轻肾间质纤维化［6］。故本研究采用扶肾降浊方治疗系膜增生性肾炎肾小管间质损害，探究其保护作用机理。研究结果显示，造模16和20周末，大鼠血清肌酐和尿素氮水平升高，24 h尿蛋白定量增高，提示肾功能受损。血中 β2-MG几乎完全从肾小球滤过，滤过的β2-MG 99.9%被近曲小管上皮细胞吸收并分解代谢。因此，正常人尿液中含量甚微，当近曲小管受损时，尿液中 β2-MG含量就会增加。造模后大鼠β2-MG增高，提示肾小管受损。病理形态结果显示，模型组肾小管上皮细胞出现肿胀、颗粒变性、坏死，个别小管完全萎缩，间质局部纤维化，且随着造模时间延长，肾小球和肾小管结构进一步破坏，小管变性、坏死程度加重，肾小球和间质有大量纤维组织增生及炎细胞浸润。中药组和贝那普利组大鼠血清肌酐、尿素氮、β2-MG和24 h尿蛋白均降低，肾功能明显改善，较之模型组肾小管变性和间质纤维化程度皆较轻。结果表明，扶肾降浊方可明显改善患病大鼠肾功能，减轻肾脏病理改变，保护肾脏。

扶肾降浊方由山茱萸、生黄芪、白花蛇舌草、丹参、鬼箭羽、益母草6味中药组成，山茱萸益肝肾之阴，敛精固涩;生黄芪补肺脾之气，二药相伍，使滋阴不至于呆腻，补气不过于温燥以扶肾固本;白花蛇舌草清热利湿解毒;丹参、鬼箭羽、益母草活血化瘀，利水消肿，清除体内久蕴之湿热、瘀浊等病理产物，恢复机体的正常代谢功能以治标。诸药合用，标本兼治，既有整体调节又有对因治疗，从而达到控制疾病进展的目的。

［1］刘震，周树录，谭建三，等.大鼠系膜增殖型肾小球肾炎模型的改进［J］.华西医科大学学报，1996，27(2):182-184.

［2］Reilly RF，Bulger RE，Kriz W.Structrue-function relationships in the kidnety//Schirier RW.Diseases of the kidney and Urinary tract.8th ed［M］.Philadelphia:Lippincott William＆Wilkins，2007:2-53.

［3］王海燕.肾脏病学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2012: 1016-1023.

［4］李国霞.系膜增生性肾炎大鼠肾小管间质损害的相关因素及疏利少阳法之肾疏宁作用机理的研究［D］.天津:天津中医学院，2005:1-153.

［5］李国霞，黄文政.系膜增生性肾炎肾小管间质损害的中医病因病机探讨［J］.江苏中医药，2008，40(4):12-13.

［6］苏玮莲，李春雨，李国霞，等.扶肾降浊方对系膜增生性肾炎肾小管间质损害大鼠COLⅠ及COLⅢ蛋白和基因表达的影响［J］.上海中医药杂志，2014，48(12):80-84.

Protective Effect of Fushen Jiangzhuo Decoction on the Renal Tubular Interstitial Damage in Rats with Mesangial Proliferative Glomerulonephritis

SU Wei-lian1，2，LI Guo-xia2△，Ning Zhi-fen2，LI Chun-yu2，LI Jing-xiu2，WEI Xiao-lu2
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicice，Tiaojin 300193，China; 2.Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)

Objective:To observed the effect of“supporting kidney to eliminate turbid fluid”prescription on protection of tubulointerstitial injury in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis.Methods:Using mesangial proliferative glomerulonephritis model，rats were randomly divided into normal group，model group，TCM group and western medicine group.Experiments were observed for 16weeks and 20weeks of effect of TCM which can support kidney to eliminate turbid fluid on protection of tubulointerstitial injury in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis，and set benazepril served as positive controls.Results After making model for 16weeks，20weeks，the rats blood creatinine，urea nitrogen，β2-MG and 24-hour urine protein of model group and TCM group were significantly higher than normal group，compared with the model group，TCM group and benazepril group were decreased significantly;Tubular damage，renal interstitial fibrosis were obviously observed on model group and increased with age，TCM group and benazepril group had less tubular damage，renal interstitial focal fibrosis.Conclusion:TCM which can support kidney to eliminate turbid fluid can improve the kidney function of the rats with mesangial proliferative glomerulonephritis，decrease the tubulointerstitial injury and protect the kidney.

Mesangial proliferative glomerulonephritis;Tubulointerstitial lesions;Supporting Kidney to Eliminate Turbid Fluid;Effect of protection

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0342-03

2015-02-09

天津市自然科学基金资助项目(11JCYBJC12800)-扶肾降浊法调控纤维化因子保护肾小管间质损害的机理

苏玮莲(1981-)，女，广西人，讲师，医学硕士，从事中医药治疗肾病的机制研究。

△通讯作者:李国霞(1967-)，女(满族)，河北人，教授，医学博士，从事中医药治疗肾病的机制研究，Tel:022-83336911，E-mail:liguoxia96@126.com。