旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆及海马神经递质的影响*

王爱梅，耿若君，李 弋，陈亚奇，未小明，张 珊，张 廷

(南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473061)

旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆及海马神经递质的影响*

王爱梅，耿若君，李 弋，陈亚奇，未小明，张 珊，张 廷

(南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473061)

目的:观察旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆能力及海马神经递质的影响。方法:健康成年SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、药物低、高剂量组。皮下注射D-半乳糖联合双侧海马注射Aβ25-35构建老年痴呆大鼠模型，各组给予相应药物灌胃治疗8周。用药结束后，观察各组大鼠学习记忆能力、海马神经元形态变化及海马中NE、DA、5-HT的含量和ChAT、AChE的酶学活性。结果:与模型组比较，药物高剂量组潜伏期延长，错误次数降低;海马中锥体细胞形态结构基本正常，细胞脱失现象较少;NE、DA和5-HT含量增高，ChAT活性升高，AChE活性降低。结论:旱莲草可改善老年痴呆模型大鼠学习记忆功能，其机制可能与改善海马神经元形态结构、减少神经元细胞丢失、改善海马中神经递质的代谢有关。

旱莲草;老年痴呆;学习记忆;NE;DA;5-HT;ChAT;AChE

老年性痴呆又称阿尔茨海默病 (alzheimer’s disease，AD)，以记忆力减退、认知功能障碍为特征，目前尚无满意的治疗药物。单胺类神经递质和胆碱能神经递质是脑内的重要神经递质，与大脑的学习记忆和认知能力有密切关系［1］。旱莲草为菊科一年生草本植物鳢肠的全草，为中医常用的养肝益肾、凉血止血药物。有研究报道，临床服用含有旱莲草的复方抗衰老胶囊，可有效改善老年痴呆的临床症状［2］。本实验以皮下注射 D-半乳糖联合双侧海马注射Aβ25-35方法构建老年痴呆大鼠模型，通过观察旱莲草对模型大鼠学习记忆能力及海马神经元形态结构和海马中单胺类神经递质和胆碱能神经递质含量的影响，进而探讨其作用机制，为临床治疗老年痴呆提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康 SPF级成年 SD大鼠40只，体质量(220±20)g，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供 (许可证号 SCXK(豫)2010-0002)。

1.1.2 实验药物及试剂 D-半乳糖，上海国药集团化学试剂有限公司(批号20130812);Aβ25-35，美国Sigma试剂公司(批号A4559);旱莲草，河南省南阳市医药公司;20%乌拉坦，上海国药集团化学试剂有限公司(批号T20130810);去甲肾上腺素测试盒、多巴胺测试盒、5-羟色胺测试盒、胆碱乙酰转移酶试剂盒和乙酰胆碱酯酶试剂盒(南京建成生物工程研究 所，批 号 分 别 为 RT131026、RT131123 和RT131122、20130920，20130911);考马斯亮兰蛋白测试盒(批号20131008)。

1.1.3 实验仪器 立体定位仪，成都仪器厂;大鼠避暗仪，中国医学科学院药物研究所;酶联免疫检测仪，美国伯乐公司;V-1200型可见分光光度计，上海棱谱仪器仪表有限公司;FSH-Ⅱ型高速电动匀浆机，江苏金运市环宇科学仪器厂;SSW型微电脑电热恒温槽，上海博迅实业有限公司医疗设备厂; AE-100型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.1.4 旱莲草提取物的制备 取旱莲草500 g加自来水2500 ml煎煮30 min，四层纱布过滤，药渣用2000 ml自来水煎煮30 min过滤，合并滤液，浓缩至1 g/ml，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 实验动物在标准环境适应性饲养1周后，按随机数字表法分为对照组、模型组、药物低、高剂量组，各组10只。模型组皮下注射D-半乳糖150 mg/kg/d，连续6周，第7周双侧海马注射4nmol/L的 Aβ25-35(用0.9%的生理盐水溶解)1次(具体操作详见方法1.2.2);对照组皮下注射等量生理盐水，连续6周，第7周双侧海马注射等量生理盐水1次;药物低、高剂量组皮下及双侧海马注射与模型组相同，药物组开始造模第1天即开始分别给予8 g/kg、24 g/kg旱莲草水提物灌胃，均为每日1次，连续8周;对照组和模型组每天给予等剂量生理盐水灌胃，连续8周。各组动物每周记录1次体质量，调整注射剂量。

1.2.2 双侧海马注射方法 10%水合氯醛麻醉大鼠后，将其固定于脑立体定位仪上，头顶皮肤剪毛，碘伏消毒。手术刀正中矢状划开头皮，剥离骨膜，暴露前囱点(Bergam点)，以Bergam点为坐标原点，参照Paxinos大鼠脑立体定位图谱［3］，由 Bergam点向后3.2 mm，中线旁2.2 mm，骨钻钻透双侧颅骨，脑立体定位仪引导下，微量注射器将总量为4 μl的药物缓慢注入双侧海马内 (每侧2 μl)，深度为4 mm，速度为0.2 μl/min，注射完成后留针5 min。术毕颅骨上的注射孔用骨蜡封闭、缝合皮肤并给予抗生素处理。

1.2.3 大鼠学习记忆能力测定(避暗实验)

避暗箱内有一圆形洞口连接明、暗两室，暗室底部由铜栅构成，通36 V交流电。实验前，先将大鼠放入避暗箱中适应环境3 min，然后接通铜栅电源，将大鼠放入明室(背对洞口)，因天生具有嗜暗习性大鼠会穿过圆孔进入暗室，在暗室遭到电击后返回明室，从而获得暗室遭受电击记忆，如此反复训练几次。24 h后开始测试，记录潜伏期(从大鼠放入明室至第1次进入暗室遇到电击所需时间)和错误次数(5 min内大鼠受到电击的次数)。如果5 min内大鼠未进入暗室，则潜伏期记为300 s，错误次数记为0次［4］。

1.2.4 大鼠海马病理形态观察 大鼠断头处死后，在冰冻手术台上迅速取脑，取出一侧海马组织，40 g/L的多聚甲醛固定 2～5 d。常规石蜡切片，厚约5 μm，HE染色，观察海马CA1区神经元形态变化。

1.2.5 大鼠海马中单胺类神经递质和胆碱能神经递质的检测 将取出的另一侧海马组织放在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血渍，滤纸拭干、称重，加入9倍体积生理盐水，用组织匀浆机把海马组织进一步粉碎，离心机(3500 r/min)离心15 min，取上清液，即得10%组织匀浆。按照试剂盒说明书，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，酶联免疫吸附法测定去甲 肾 上 腺 素 (norepinephrine，NE)、多 巴 胺(dopamine，DA)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)含量，化学比色法测定胆碱乙酰转移酶(choline acetyl-transferase，ChAT) 和 乙 酰 胆 碱 酯 酶(acetylcholin esterase，AChE)活力。

1.2.6 统计学方法 采用 SPSS 18.0统计软件进行统计分析，以均数±标准差(±s)表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，(P＜0.05)为差异有统计学意义，(P＞0.05)为差异无统计学意义。

2 结果

2.1 旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响(避暗实验)

表1显示，与对照组比较，模型组的潜伏期明显缩短，错误次数增加(P＜0.01);与模型组比较，药物低、高剂量组潜伏期明显延长(P＜0.01)，高剂量组错误次数显著降低(P＜0.01)。

表1 各组大鼠学习记忆能力比较(±s)

表1 各组大鼠学习记忆能力比较(±s)

注:与对照组比较:aP＜0.01;与模型组比较:bP＜0.01;与低剂量组比较:cP＜0.01

组 别 鼠数 潜伏期(s) 错误次数(次) 10 212.16± 8.66 1.60±0.52模 型 组 10 155.85±12.98a 2.60±0.70a低 剂 量 组 10 178.79±13.56b 2.10±0.57高 剂 量 组 10 198.55±12.13bc 1.80±0.79对照组b

2.2 旱莲草对老年痴呆模型大鼠海马CA1区神经元细胞的影响

图1显示，光镜下观察各组大鼠海马CA1区结构如下:对照组锥体细胞排列紧密，细胞结构清晰，大小一致;与对照组比较，模型组锥体细胞排列紊乱，结构不清晰，细胞脱失明显;与模型组比较，低剂量组锥体细胞排列不整齐，细胞有脱失，高剂量组锥体细胞形态结构基本正常，细胞脱失较少。

2.3 旱莲草对老年痴呆模型大鼠海马 NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马中NE、DA、5-HT含量明显降低(P＜0.01);ChAT活性明显下降，AChE活性明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，药物高剂量组大鼠海马中NE、DA、5-HT含量明显增加(P＜0.01)，ChAT活性明显升高，AChE活性明显降低(P＜0.01)。药物低剂量组和模型组之间上述指标无明显改变(P ＞0.05)。

表2 各组大鼠海马NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性检测结果(±s)

表2 各组大鼠海马NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性检测结果(±s)

注:与对照组比较:aP＜0.01;与模型组比较:bP＜0.01;与低剂量组比较:cP＜0.01

组 别 NE(μg/g) DA(μg/g) 5-HT(μg/g) ChAT(U/g) AChE(U/mgprot)对 照 组 0.607±0.096 0.827±0.078 0.700±0.066 131.350±16.257 0.694±0.092模 型 组 0.426±0.074a 0.639±0.084a 0.533±0.094a 89.352± 5.970a 0.936±0.163a低 剂 量 组 0.455±0.112 0.685±0.054 0.580±0.111 91.252± 5.522 0.898±0.115高 剂 量 组 0.536±0.069b 0.754±0.110b 0.650±0.090b 113.950±10.946bc 0.740±0.095bc

图1 各组大鼠海马CA1区神经元形态结构改变(HE染色 10×40)

3 讨论

中医理论认为，AD的发生是由于“肾虚精亏、瘀血阻络”。旱莲草入肝、肾经，具有滋阴补肾、凉血止血之功效［5］，符合 AD的治疗理论。学习记忆水平是AD诊断和治疗评价中最重要的指标［6］。避暗试验最早在1967年由 Jarvik和 Kopp创建，是用来检测大小鼠被动回避学习记忆能力的经典行为学方法［7-8］，即潜伏期越长，错误次数越少，表明大鼠学习记忆能力越好。本实验中避暗实验发现，与模型组比较，旱莲草低、高剂量治疗组大鼠潜伏期明显延长，高剂量治疗组错误次数明显降低，说明旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆能力下降有一定的治疗作用，且采用高剂量治疗疗效更好。

研究表明［9-10］，学习记忆功能减退与海马的质量减轻、神经元数目减少及神经元突触的可塑性改变有关。AD患者海马的病变往往早于大脑皮质的改变，且随着病程的延长，病变有加重趋势。本实验结果显示，模型组海马轮廓模糊，细胞间界限不清，神经元细胞数目减少;药物高剂量组中海马结构明显改善，轮廓清晰，锥体细胞形态结构基本恢复正常，细胞脱失减少，说明旱莲草对受到损伤的海马神经元细胞具有保护作用，可通过减少神经元细胞的凋亡起到治疗AD的作用。

单胺类神经递质和胆碱能神经递质是脑内重要的神经递质，对学习记忆有重要的调节作用。NE通过轴突联系广泛投射到大脑中枢神经系统，调节大脑皮质的兴奋状态，对觉醒、情绪、认知功能和运动有着广泛影响［11］。DA具有多种生物学效应，如抑制脂质过氧化，减少氧化应激损伤，增加脑部血流供应，改善脑部神经元利用葡萄糖等，与NE一起协同调节机体的兴奋状态［12］。5-HT通过调节乙酰胆碱(acetyl choline，ACh)在脑组织中的释放，从而调节中枢胆碱能神经活动，是维持智力的重要神经递质［13］。ACh含量的减少程度与 AD的临床症状严重程度密切相关。ChAT是合成 ACh的关键酶，AChE是降解ACh的关键酶，ChAT和AChE的活性与脑内ACh的含量密切相关，两者共同维持ACh含量的动态平衡。临床研究结果显示，老年人体内单胺类神经递质和胆碱能神经递质的减少直接导致老年性痴呆的形成［11-13］。本实验结果发现，与模型组比较，药物高剂量组大鼠海马中NE、DA和5-HT含量均明显增加，ChAT活性明显升高，AChE活性明显降低，说明ACh含量明显增加。这表明旱莲草可以改善海马中单胺类神经递质和胆碱能神经递质的代谢，增加海马中NE、DA、5-HT和ACh的含量，在改善学习记忆功能方面发挥一定的作用。

综上所述，旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆功能有改善作用，其机制可能与改善AD模型大鼠海马神经元形态结构、减少神经元细胞的丢失，改善海马中单胺类神经递质和胆碱能神经递质的代谢、增加海马中NE、DA、5-HT和ACh的含量有关。

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Effect of Eclipta on Learning and Memory and Hippocampal Neurotransmitters in the Senile Dementia Model Rats

WANG Ai-mei，GENG Ruo-jun，LI Yi，CHEN Ya-qi，WEI Xiao-ming，ZHANG Shan，ZHANG Ting
(Nanyang Medical College，Henan Nanyang 473061，China)

Objective:To study the effect of Eclipta alba on learning and memory and hippocampal neurotransmitters in Alzheimer’s disease model rats.Methods:Healthy adult SD rats were randomly divided into 4 groups:control group，model group，low dosage group and high dosage group.The model of Alzheimer’s disease was established with subcutaneous injection of D-galactose and microinjection Aβ25-35on bilateral hippocampus.All rats were treated with different drug lasting 8 weeks.Then，the learning and memory ability of rats were determined.The pathomorphological changes of hippocampal neuron were observed.The contents of norepinephrine(NE)、dopamine(DA)、5-hydroxytryptamine (5-HT)and the activities of choline acetyl-transferase(ChAT)、acetylcholin esterase(AChE)on hippocampus were measured.Results:Compared with the model group，the incubation period prolonged and the error times decreased remarkably in high dosage group;the pyramidal cells decreased insignificantly with the basic restoration of cell morphology in high dosage group;the content of NE、DA and 5-HT increased significantly;the ChAT activity increased significantly，the AChE activity decreased significantly in high dosage group.Conclusion:Eclipta alba could raise the learning and memory function of AD rats by the mechanism of improving the hippocampus nerve cells’morph and structure，improving the metabolism of neurotransmitters on hippocampus.

Eclipta alba;Alzheimer’s disease;Learning and memory;NE;DA;5-HT;ChAT;AChE

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0332-04

2015-07-16

河南省重点科技攻关项目(132102310263)

王爱梅(1973-)，女，副教授，从事生理学教学与研究。