益气复脉合剂抗乌头碱致大鼠心肌细胞动作电位异常的研究*

武 乾，李昊娲，石晓路，孙明杰，林 谦，李 岩△

（1.北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，中国中医科学院医学实验中心，北京 100700；2.首都医科大学附属北京安贞医院，北京 100029；3.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

益气复脉合剂抗乌头碱致大鼠心肌细胞动作电位异常的研究*

武 乾1，李昊娲2，石晓路1，孙明杰1，林 谦3，李 岩3△

（1.北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，中国中医科学院医学实验中心，北京 100700；2.首都医科大学附属北京安贞医院，北京 100029；3.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

目的：利用膜片钳技术阐述益气复脉合剂抗心律失常的作用机制。方法：采用酶解法分离大鼠心肌细胞，利用膜片钳方法考察益气复脉合剂抗乌头碱致大鼠心肌细胞动作电位异常的作用。结果：益气复脉合剂可显著缩短乌头碱所致动作电位时程APD、APD50、APD90的延长，对静息电位、超射、幅度及最大上升速率并无明显改变。结论：益气复脉合剂抗乌头碱致室性心律失常的作用机制可能与抑制心室肌细胞的Ca2＋内流以及K＋外流有关。

益气复脉合剂；动作电位；全细胞膜片钳

室性心律失常是指起源于心室的心律紊乱，不但有可能加重原有心脏疾病，还可能导致患者突然死亡［1］，严重威胁人类健康。目前西医抗心律失常的药物均存在致心律失常作用，尚未发现安全有效的药物。中医药在室性心律失常的临床治疗上显示出一定优势［2］，而对其抗心律失常的机制既往文献也有报道。益气复脉合剂具有益气活血、祛痰安神功效，且临床多年应用有效。本课题组早期研究中证实，其具有抗乌头碱致实验性室性心律失常作用［3］，可有效延迟室性心律失常及心脏停搏出现时间。同时也对其可能的机制进行了初步研究［4］，发现益气复脉合剂可以缩短异丙肾上腺素导致的动作电位延长。在此基础上，本研究旨在进一步研究其抗心律失常作用机制，为抗心律失常中药的研发提供完整、可靠的数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证0229769）。

1.2 药物与试剂

益气复脉合剂组成：中药饮片党参、黄连、半夏、鬼箭羽、川芎、丹参、赤芍、白芍、炙甘草、酸枣仁和远志购自康仁堂，由东方医院制剂室水煮浓缩，药物终浓度4.13 g／ml；乌头碱（Acontine）购自成都曼思特生物科技有限公司（批号MUST⁃11031101）；Ⅱ型胶原酶（collagenase type 2）购自美国Washington公司；NaCl、KCl、HEPES、D⁃Glucose、NaOH、CaCl2、KOH、MgCl2、KH2PO4、MgSO4、L⁃Glutamic、Taurine、EGTA、Na2ATP等购自美国Alfa公司；牛血清白蛋白、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。

1.3 主要溶液配制

乌头碱溶液浓度为10 μmol／L。无钙台氏液（Tyrode solution，mmol／L）：NaCl 140.0，KCl 5.4，MgCl21.0，HEPEs 10.0，D⁃Glucose 10.0，NaOH调至pH 7.4；有钙台式液：在无钙台式液基础上加1.8 mmol／L CaCl2；KB液（mmol／L）：KOH 80.0，KCl 40.0，KH2PO425.0，MgSO43.0，L⁃Glutamic 50.0，Taurine 20.0，EGTA 1.0，D⁃Glucose 10.0，KOH调节至pH 7.2；消化液：含60%Collagenase type 2＋20%BSA ＋50 μmol／L Ca2＋的无钙台氏液；动作电位电极内液（mmol／L）：NaCl 10.0，KCl 120.0，MgCl25.0，HEPEs 20.0，EGTA 5.0，Na2ATP 3.0，KOH调节至pH 7.2；给药溶液为有钙台式液＋10 μmol／L乌头碱（Acontine）；浴槽溶液为有钙台式液。

1.4 实验仪器与器材

RM6240型多通道信号处理系统，成都仪器厂；ALC⁃IP微量泵，上海奥尔科特生物科技有限公司；渗透压仪Fiske 210，美国ADVANCE公司；微电极拉制仪，DMI⁃Universal Puller；放大器EPC 10，美国HEKA 公 司；微 操 MP⁃225，美 国 SUTTER INSTRUMENT COMPANY；显微镜 IX71，日本OLYMPUS公司；微电极B15014F，武汉微探科学仪器有限公司。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与给药 空白对照组（简称对照组，Control）给予蒸馏水3.48 ml／kg／d灌胃，益气复脉合剂组（简称中药组，CM）给予益气复脉合剂3.48 ml／kg／d灌胃，连续给药7 d。

1.5.2 心室肌细胞分离 末次给药1 h后，用10%水合氯醛溶液麻醉开胸，迅速取出心脏，置于4℃台式液中清理和冲洗残余血液，并迅速挂于Langendorff装置上进行主动脉逆行灌注，在36.7℃、6 ml／min恒速灌流。100%氧气饱和的有钙台式液灌流约3 min后，切换100%氧气饱和的无钙台式液灌流5 min，然后迅速切换消化液循环灌流，并持续通以100%氧气。灌流中同步监测灌注压，当灌注压恢复到略低于初始灌流压力时终止消化。用10 ml无钙台氏液灌流冲洗残余消化液，然后于KB液中剪取左心室，并于KB液中保存。

1.5.3 全细胞膜片钳记录及数据处理 所用微电极三步拉制抛光，充灌电极液后电极阻抗约为2～6 MΩ。采用全细胞电流钳技术记录模式 C⁃CLAMP。细胞浴槽保持恒速灌流。取细胞悬液加入浴槽，台式液灌流以2 ml／min恒速灌流。选取杆状、横纹清晰、无自主收缩的心室肌细胞进行实验。调节微操使电极尖端逐渐向所选定的细胞靠近，形成高阻封接后负压抽吸打破细胞膜，形成全细胞模式。动作电位（action potential，AP）的刺激模式为脉宽5 ms、电流900 pA。在台式液中记录到动作电位后，稳定10 min转换为乌头碱灌流液灌流30 min。记录乌头碱灌流前后的静息电位（resting potential，RP）、动作电位幅度 （action potential amplitude，APA）、超射（overshoot，OS）、动作电位最大除极速率（maximum，Vmax）、动作电位时程（action potential duration，APD）、动作电位复极至25%、50%、90%的时间（action potential duration at 25%、50%、90%，APD25、APD50、APD90）。

1.5.4 统计学方法 采用 Fit Clamp、Origin 8.0、Excel 2007、SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间及组内前后比较采用单因素检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益气复脉合剂对心室肌细胞静息电位、超射、幅度及最大上升速率的影响

表1显示，乌头碱灌流前后，中药组与对照组在静息电位、超射、动作电位幅度及最大上升速率方面比照灌流前无明显变化（P＞0.05）。乌头碱灌流后，中药组较对照组在静息电位、超射、动作电位幅度及最大上升速率方面无明显变化（P＞0.05）。

表1 益气复脉合剂对心室肌细胞静息电位、超射、幅度及最大上升速率的影响（±s，n＝10）

表1 益气复脉合剂对心室肌细胞静息电位、超射、幅度及最大上升速率的影响（±s，n＝10）

组 别 例数 时 间 RP／mV OS／mV APA／mV Vmax（V／S）对照组 10 灌流前 －67.35±0.21 48.21±1.65 113.73±6.20 112.68±5.56 10 灌流后 －68.32±1.05 48.15±8.84 136.83±8.86△ 116.84±7.65中药组 10 灌流前 －67.43±0.36 47.44±3.94 113.92±4.65 114.52±5.21 10 灌流后 －68.06±0.87 47.74±7.33 138.94±7.63△ 118.65±5.48

2.2 益气复脉合剂对心室肌细胞动作电位时程的影响

表2图1显示，乌头碱灌流前，中药组与对照组在APD、APD25、APD50、APD90方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。乌头碱灌流后，对照组APD、APD50、APD90均较灌流前显著延长（P＜0.01），中药组APD、APD50、APD90均较灌流前显著延长（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；中药组较对照组 APD、APD50、APD90显著缩短（P＜0.01）。

3 讨论

在选用抗心律失常药物时，应充分考虑其作用靶点，尤其是对各种离子通道的抑制作用。一个理想的抗心律失常药物应对至少2种以上靶点有作用。目前，西医常用的抗心律失常药物（AAD）均存在致心律失常作用［6］。Ic类抗心律失常药物氟卡尼、恩卡尼和莫雷西嗪在治疗急性心肌梗死后的恶性心律失常预初试验（CAPT试验）中均表现出良好的抑制室性心律失常作用和极佳的顺从性，但CAST试验却证实其可显著增加心肌梗死患者的猝死和死亡风险。近20年来，随着心脏起搏与心电生理专业的迅速发展，现在已有很多非药物治疗方法，但由于其适应症、并发症及费用昂贵等原因，大多数心律失常患者仍需药物治疗。达到抗乌头碱所致室性心律失常的作用，这也与本课题前期动物实验结果相符［3⁃4］。APA可以反映Na＋内流的总量，体现了钠离子通道的功能［7］；乌头碱所致心室肌APD50的延长主要与Ca2＋内流以及K＋外流有关［10］，这2种通道是心室肌细胞复极2期的主要电流；心室肌APD90的延长则主要与K＋外流有关，这是心室肌细胞终末快速复极期的主要电流。

表2 益气复脉合剂对心室肌细胞动作电位时程的影响（±s）

表2 益气复脉合剂对心室肌细胞动作电位时程的影响（±s）

注：与对照组比较：∗∗P＜0.01；乌头碱灌流前后组内比较：△P＜0.05；乌头碱灌流前后组内比较：△△P＜0.01

组 别 例数 时 间 APD APD25 APD50／ms APD90／ms对照组 10 灌流前 72.63±5.66 6.53±2.13 17.65±1.15 50.50±3.75 10 灌流后 113.24±6.74△△ 6.74±3.01 30.10±1.75△△ 82.13±8.82△△中药组 10 灌流前 73.56±2.14 6.28±2.54 18.15±2.75 52.50±4.15 10 灌流后 92.85±7.23∗∗△ 6.76±3.58 22.45±2.32∗∗△△ 59.73±5.56∗∗△△

图1 心室肌细胞动作电位

乌头碱灌流后，较对照组而言中药组的APD、APD50、APD90度均显著缩短，由此可推测益气复脉合剂拮抗乌头碱致室性心律失常作用的机制可能与抑制心室肌细胞的Ca2＋内流以及K＋外流有关。而本实验显示，乌头碱灌流前后APA及Vmax则未见显著差异，可推测本方抗心律失常作用机制可能与Na＋离子通道无关。如需确定益气复脉合剂对相关K、Ca通道的确切影响，还需要进一步的实验研究。

中医药多成分多靶点的治疗方式对此有较大优势。益气复脉合剂以党参为君，佐以炙甘草，二者合用益气复脉、和胃生津；鬼箭羽、川芎、丹参、赤芍合用，活血祛瘀作用显著；黄连、半夏燥湿化痰，白芍、酸枣仁、远志合用养血柔肝、宁心安神，兼有祛痰之功效，在临床使用中都表现出较好的治疗室性心律失常作用。本课题前期研究也显示，本方可有效拮抗乌头碱、异丙肾上腺素所致大鼠室性心律失常［3⁃4］。

心脏电信号传导的基础是心肌细胞跨膜离子通道电流。心肌细胞钠、钾、钙等离子通道顺序开放并保持动态平衡是心脏正常工作的基础。动作电位分为5个时相：0相为快速去极，是Na＋快速内流所致；1相为快速复极初期，由Ito通道K＋短暂外流所致；2相平台期为缓慢复极，由Ca2＋及少量Na＋内流与缓慢激活的IKs通路K＋外流所致；3相为快速复极末期，由快速开放的IKr通路的K＋外流所致；4相为静息期，自动去极化是由内向Na＋电流所致，非自律细胞在生理状态下膜电位维持在静息水平。一些心律失常易感因素可能通过影响钠、钾、钙等离子通道的功能，引起离子通道间的平衡失调，使心肌电信号的传导紊乱而致心律失常发生［1，5⁃6］。

通过本实验可以看出，乌头碱可以延长大鼠心肌细胞APD，过度延长APD即可诱发心律失常。而益气复脉合剂则可通过缩短乌头碱所致APD延长

［1］ Myerburg RJ，et al.Frequency of sudden cardiac death and profiles of risk［J］.Am J Cardiol，1997，80：10F.

［2］ 李勇.心律失常中医药研究进展［J］.天津中医药，2005，22（4）：345.

［3］ 武乾.益气复脉合剂抗实验性室性心律失常作用研究［J］.中国中医基础医学杂志，2013，19（9）：1017⁃1018.

［4］ 李昊娲.益气复脉合剂抗心律失常作用机制研究［J］.中西医结合脑血管病杂志，2015，13（2）：132⁃134.

［5］ 李鸥.1072例冠心病住院患者中医证候分布特点的多中心横断面研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2011，9（4）：385⁃386.

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Research of Yiqi Fumai Mixture of Abnormal Myocardial Cell Action Potential in Rats Induced by Anti Aconitine

WU Qian1，LI Hao⁃wa2，SHI Xiao⁃lu1，SUN Ming⁃jie1，LIN Qian3，LI Yan3△
（1.Beijing Key Laboratory of TCM Basic Research on Prevention and Treatment of Major Disease Medical Experimental Center，CACMS，Beijing 100700，China；2.Beijing Anzhen Hospital，CMU，Beijing 100029，China；3，Dongfang Hospital BUCM，Beijing 100078，China）

Objective：To investigate the anti⁃arrhythmic mechanism of the Yiqi Fumai mixture by the patch technique.Methods：The whole cell patch clamp was used to record the affect of the Yiqi Fumai mixture on action potential with and without acontine perfusion.Results：In C⁃clamp mode，The Yiqi Fumai mixture can significantly extend APD，APD50and APD90after aconitine perfusion.Conclusion：Yiqi Fumai mixture has anit⁃ventricular arrhythmogenic effect of aconitine，and it can against the prolongation of APD caused by aconitine，which maybe related to the inhibiton of the late plateau Ca2＋current and repolarization K＋current.

Yiqi Fumai mixture；Action Potential；Whole Cell Patch Clamp

R285.5

：B

：1006⁃3250（2016）10⁃1330⁃03

2016⁃03⁃28

北京中医药大学2015年度中青年教师类自主选题（面上项目）（2015⁃JYB⁃JSMS118）⁃益气复脉法干预房颤RFCA术后复发因素的研究

武 乾（1986⁃），女，山东人，助理研究员，医学硕士，从事心血管疾病药理的临床与研究。

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：李 岩（1983⁃），男，北京人，主治医师，医学博士，从事心血管药理的临床与研究，E⁃mail：erzitaba＠163.com。