风湿宁胶囊含药血清干预对CIA⁃FLS细胞增殖及凋亡的影响*

王一婕，王永辉，张晓圆，周 然

（1.成都中医药大学基础医学院，成都 610075；2.山西中医学院，山西晋中 030006）

风湿宁胶囊含药血清干预对CIA⁃FLS细胞增殖及凋亡的影响*

王一婕1，王永辉2，张晓圆2，周 然2

（1.成都中医药大学基础医学院，成都 610075；2.山西中医学院，山西晋中 030006）

目的：探讨风湿宁胶囊（FSN）含药血清干预对CIA⁃FLS细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用CCK⁃8法检测各组血清干预24、48、72 h后对CIA⁃FLS细胞增殖状态的影响；采用Annexin V⁃FITC／PI双染法通过流式细胞仪观察各组血清干预48 h后对CIA⁃FLS细胞早期和晚期凋亡情况的影响。结果：CCK⁃8法结果表明，在24 h，FSN各浓度（20%、10%和5%）含药血清干预对CIA⁃FLS细胞的增殖无抑制作用；在48 h，20%FSN含药血清和10%FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞的增殖都表现出不同程度的抑制。在72 h，FSN各浓度（20%、10%和5%）含药血清对CIA⁃FLS细胞增殖均可见显著的抑制效果，其中20%风湿宁胶囊含药血清效果最好。Annexin V⁃FITC／PI双染检测结果表明，风湿宁胶囊含药血清各浓度（20%、10%和5%）组都不同程度地提高了细胞总凋亡率，其中20%风湿宁胶囊含药血清组对CIA⁃FLS细胞凋亡促进作用最强。结论：风湿宁胶囊含药血清对CIA⁃FLS细胞增殖的抑制及凋亡的促进可能是其治疗类风湿关节炎的机制之一。

风湿宁胶囊；CIA⁃FLS细胞；增殖；凋亡

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多关节滑膜炎症为表现的系统性自身免疫性疾病［1］，主要影响外周关节，也可累皮肤、心脏、肺、眼睛等其他组织和器官。RA在我国的发病率为0.32% ～0.38%［2］，该病可发生于任何年龄，且发病率随着年龄的增长而升高。目前临床使用治疗RA药物存在明显的胃肠道不良反应、毒副作用大等缺点，有必要进一步探索RA的病理生理机制，寻找安全高效的新型治疗药物［3］。近年来，中医药在治疗RA方面有很大优势［4⁃5］，诸多方药在改善RA患者生活质量、缓解疼痛、减少致残率、减轻药物副作用方面都有重要临床价值和广阔应用前景。

类风湿关节炎属于中医学“痹症”范畴。在《内经》三气致痹学说中，寒湿二邪尤为重要，因寒湿二邪均为阴邪且寒性凝滞，寒邪客于经脉，气血为寒邪所凝滞、闭阻不通、不通则痛。气血凝滞不通，表现为关节冷痛、湿性重浊黏滞、阻碍气血运行表现为肢体疼痛重着，二者相感病情多缠绵难愈。总之，痹症的病理因素不离风、寒、湿、热、痰、瘀诸方面。

风湿宁胶囊（FSN）主治风寒湿兼瘀血阻络型痹症，源于山西名老中医白清佐教授的经验方，由17味中药组成（羌活［6⁃7］、独活［8⁃9］、青风藤［10⁃11］、威灵仙［12⁃13］、片姜黄、防风、川芎［14］、麻黄、肉桂、三棱、血竭、延胡索、川牛膝、熟地黄［15］、砂仁、生姜和甘草），具有祛风散寒、除湿通络、活血止痛之功。自20世纪80年代开始，风湿宁胶囊就以医院制剂的形式用以治疗类风湿疾病。经过多年的临床应用证明，其可明显改善患者症状、体征，延缓阻止病情进展且抗炎作用良好［16］。本文试图从细胞水平探讨风湿宁胶囊治疗类风湿关节炎的生物学机制，阐释其部分作用机理，拓宽其应用空间，也为寻求中医药治疗类风湿关节炎提供实验依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

Annexin V⁃FITC／PI双染细胞凋亡检测试剂盒：南京碧波（BA12100）；Enogene Cell Counting kit⁃89：EnoGene（E1CK⁃000208⁃10）；胎牛血清：Gibco（10100⁃147）；0.25%胰酶溶液：基诺生物（GNM15050）；DMEM／F12培养基：HyClone（SH30023.01B）；T25培养瓶：Corning（430168）；96孔板：SIGMA（SIAL0596）；6孔板：SIGMA（SIAL0516）。

1.2 实验仪器

FACSCalibur流式细胞仪：美国BD公司；倒置荧光显微镜：日本OLYMPUS；iMark型酶标仪：美国Bio⁃Rad；细胞培养箱：力康生物医疗科技控股集团（Heal Force HF151／212）；显微镜：上海长方光学仪器有限公司。

2 方法

2.1 大鼠成纤维滑膜细胞的传代培养

将模型大鼠膝关节滑膜组织取出后进行原代培养，等待组织块周围的滑膜细胞生长至约覆盖培养瓶瓶底80%面积时进行第1次传代培养，待细胞再次增殖至覆盖约80%培养瓶瓶底时，按上述步骤再次对其传代，直至第4代后进行实验研究。

2.2 FSN含药血清的制备

取SPF级SD大鼠60只，随机分为正常血清对照组、风湿宁胶囊血清组（0.66 g／kg）和Tofacitinib血清组（15 mg／kg）3组各20只。对各组大鼠每天灌胃2次，正常血清对照组用等量生理盐水进行灌胃，持续7 d。第7天末次给药后1 h采用乙醚对大鼠进行麻醉，随后对其行腹主动脉取血，并放入37℃温箱静置1 h后，以3000 r／min／r离心10 min，收集上清。同组血清混匀后，在56℃水浴条件下灭活30 min，并采用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装入2 ml离心管，置－20℃保存备用。并将获取的风湿宁胶囊含药血清按比例与DMEM／F12培养基配制成浓度分别为5%、10%、20%的培养液备用。

2.3 细胞分组与用药

采用“2.1”项下模型大鼠第3代成纤维滑膜细胞，各组在加血清前先对成纤维滑膜细胞进行饥饿24 h，并分为空白血清对照组、Tofacitinib含药血清组、20%含药血清组、10%含药血清组、5%含药血清组。

2.4 CCK⁃8法检测CIA⁃FLS增殖率

采用CCK⁃8法确定风湿宁胶囊对CIA大鼠成纤维滑膜细胞增殖的影响。用风湿宁胶囊含药血清干预CIA大鼠成纤维滑膜细胞24、48、72 h后，通过对OD值检测来间接反映细胞的活力和数量。

2.5 Annexin V⁃FITC／PI双染法检测CIA⁃FLS凋亡率

Annexin V⁃FITC／PI双染法检测FSN含药血清干预对CIA⁃FLS凋亡的影响。采用Annexin V⁃FITC和PI的荧光标记通过流式细胞仪来检测CIA⁃FLS细胞的凋亡比例。Annexin V⁃FITC和PI染色阴性代表正常细胞，Annexin V⁃FITC染色阳性同时PI阴性代表早期凋亡细胞，Annexin V⁃FITC和PI同时阳性代表坏死的细胞。

2.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多组间比较采用LSD检验，不同时间点比较采用重复测量资料方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 FSN含药血清对CIA⁃FLS增殖抑制影响

表1图 1显示，采用 CCK⁃8法观察各浓度（20%、10%和5%）风湿宁胶囊含药血清对 CIA⁃FLS细胞增殖的抑制作用。实验结果表明，24 h与空白血清对照组比较，各浓度（20%、10%和5%）的风湿宁胶囊含药血清组OD值未见明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05），而Tofacitinib含药血清组OD值出现明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与 Tofacitinib含药血清组比较，各浓度（20%、10%和5%）风湿宁胶囊含药血清组OD值出现明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。48 h与空白血清对照组比较，Tofacitinib含药血清组、20%风湿宁胶囊含药血清组和10%风湿宁胶囊含药血清组OD值出现明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），5%FSN含药血清组OD值未见明显下降，差异无统计学意义（P＞0.05）；与Tofacitinib含药血清组比较，各浓度（20%、10%和5%）风湿宁胶囊含药血清组OD值出现明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。72 h与空白血清对照组比较，风湿宁胶囊各浓度（20%、10%和5%）含药血清组和Tofacitinib含药血清组OD值均出现不同程度的下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Tofacitinib含药血清组比较，10%风湿宁胶囊含药血清组和5%风湿宁胶囊含药血清组OD值出现明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），20%FSN含药血清组OD值变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞OD值的影响（±s）

表1 FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞OD值的影响（±s）

注：与空白血清对照组比较：∗P＜0.05，与Tofacitinib含药血清组比较：＃P＜0.05

组别例数 24 h（OD） 48 h（OD） 72 h（OD）空 白 血 清 对 照 组 6 0.612±0.039 0.855±0.038 1.150±0.051 Tofacitinib 含 药 血 清 组 6 0.461±0.024∗ 0.561±0.036∗ 0.836±0.047∗2 0%FSN含 药 血 清 组 6 0.594±0.021＃ 0.617±0.039∗＃ 0.812±0.062∗1 0%FSN含 药 血 清 组 6 0.606±0.041＃ 0.684±0.033∗＃ 0.878±0.052∗＃5% FSN 含 药 血 清 组 6 0.614±0.050＃ 0.810±0.031＃ 0.960±0.065∗＃

图1 FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞OD值的影响

3.2 FSN含药血清对CIA⁃FLS凋亡的影响

图2 FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞凋亡的影响

图3 FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞凋亡的影响

表2图2、3显示，采用流式细胞仪对各浓度（20%、10%和5%）风湿宁胶囊含药血清干预48 h后的CIA⁃FLS细胞进行Annexin V⁃FITC／PI双染。检测结果表明，与空白血清对照组比较，各浓度（20%、10%和 5%）风湿宁胶囊含药血清组和Tofacitinib含药血清组中CIA⁃FLS细胞总凋亡率都出现不同程度的升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Tofacitinib含药血清组比较，5%FSN含药血清组CIA⁃FLS细胞总凋亡率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），20%FSN含药血清组和10%FSN含药血清组CIA⁃FLS细胞总凋亡率有所升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞凋亡的影响（±s）

表2 FSN含药血清干预对CIA⁃FLS细胞凋亡的影响（±s）

注：与空白血清对照组比较：∗P＜0.05，与Tofacitinib含药血清组比较：＃P＜0.05

组别 例数 总凋亡率（%）空 白 血 清 对 照 组 6 2.85±0.49 Tofacitinib含 药 血 清 组 6 19.14±3.37∗2 0%FSN含药血清组 6 24.46±4.69∗＃1 0%FSN含药血清组 6 26.50±3.92∗＃5%FSN含 药 血 清 组 6 15.73±3.24∗＃

4 讨论与展望

类风湿患者滑膜细胞较正常人滑膜细胞增殖较快，被认为是“肿瘤样增殖”。正常人的滑膜组织只有约1～3层，且存在于纤维性关节囊与关节腔的间隙中，由成纤维样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、蛋白多糖、胶原纤维、毛细血管和淋巴管等组成。类风湿患者的滑膜组织可以明显增厚到4～10层，增多的滑膜细胞通过侵袭作用导致类风湿关节炎的发展，所以如何能够有效地抑制滑膜组织中所占比例最高的成纤维滑膜细胞的增殖和促进其凋亡，成为临床治疗的有效途径之一。

本研究分别运用不同浓度（20%、10%和5%）的风湿宁胶囊含药血清，对第3代CIA⁃FLS体外干预不同时间（24、48和72 h）后，通过CCK⁃8法观察对CIA⁃FLS增殖的影响情况。实验结果提示，阳性药Tofacitinib含药血清起效迅速，风湿宁胶囊含药血清药力持久。从24、48和72 h这3个时间点来观察，风湿宁胶囊含药血清对CIA⁃FLS细胞增殖的抑制作用呈现出一定的时效关系，其中20%风湿宁胶囊含药血清干预72 h抑制率较高，达到34%，而在24 h时其抑制率与空白血清无明显差异，可能是中药含药血清中代谢成分起效较慢所致。

在细胞凋亡方面，本实验采用流式细胞仪通过Annexin V⁃FITC／PI双染来检测风湿宁胶囊含药血清对CIA⁃FLS细胞干预48 h后凋亡的影响。检测结果提示，风湿宁胶囊含药血清对异常增殖CIA⁃FLS细胞凋亡的促进，可能是该方在临床中治疗和缓解类风湿患者关节肿胀疼痛等症状的机制之一。由于实验仅对各浓度（20%、10%和5%）风湿宁胶囊含药血清干预CIA⁃FLS细胞48 h的凋亡进行了检测，未能了解不同时间点凋亡的动态变化，结果中Annexin V阳性同时PI阴性细胞所占比例较低，而PI阳性同时Annexin V阳性细胞所占比例较高，可能是由于含药血清干预时间较长导致多数CIA⁃FLS细胞进入了晚期凋亡。下一步的实验中，我们将会缩短风湿宁胶囊含药血清对CIA⁃FLS细胞的干预时间至12 h、24 h甚至6 h，以期更好地观察药物对细胞早期凋亡的影响。

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Effects of Serum Containing Fengshining Capsule Intervention on the Proliferation and Apoptosis of CIA⁃FLS Cells

WANG Yi⁃jie1，WANG Yong⁃hui2，ZHANG Xiao⁃yuan2，ZHOU Ran2
（1.Basic Medicine College，Chengdu TCM University，Chengdu 610075 China；2.TCM College of Shanxi，Jinzhong 030006，China）

Objective：To research the effects of FSN drug⁃containing capsule serum on CIA⁃FLS cell proliferation and apoptosis.Methods：CCK⁃8 method is used to detect serum intervention group 24，48，72 h after the impact on the CIA⁃FLS cell proliferation state；The Annexin V⁃FITC／PI double staining with flow cytometry instrument observation group serum intervention after 48 h of CIA⁃FLS the impact of early and late apoptotic cells.Results：The CCK⁃8 method detection results show that within 24 h，the concentration（20%，10%and 20%）of FSN drug⁃containing serum on the CIA⁃FLS did not appear obvious role.In 72 h，FSN each concentration（20%，10%and 5%）drug⁃containing serum and tofacitinib drug⁃containing serum on the CIA⁃FLS proliferation had visible significant inhibitory effect，of which 20%Fengshining capsules containing medicine serum works best.Annexin V⁃FITC／PI double dye test results show that the Fengshining capsules containing medicine serum concentrations（20%，10%and5%）groups each have different levels of the cell apoptosis rate，of which 20% Fengshining capsules containing medicine serum group of CIA⁃promote the strongest FLS apoptosis.Conclusion：Fengshining capsule drug⁃containing serum on the CIA⁃FLS inhibition of cell proliferation and apoptosis of promotion may be one of the mechanism of treatment of rheumatoid arthritis.

Fengshining capsule；CIA⁃FLS cells；Proliferation；Apoptosis

R285.5

：B

：1006⁃3250（2016）10⁃1326⁃04

2016⁃04⁃11

国家自然科学基金面上项目（81473589）⁃基于JAK⁃STAT信号转导通路利用蛋白组学技术从方病证相关角度研究风湿宁胶囊治疗类风湿关节炎的作用机制

王一婕（1982⁃），女，河北宁晋人，实验师，在读博士，从事方剂功效发挥机理及应用研究。