上皮-间质转化在乳腺癌中的研究进展

张 彤 综述,韩 静 审校

(天津港口医院胸外科 300456)



上皮-间质转化在乳腺癌中的研究进展

张 彤 综述,韩 静 审校

(天津港口医院胸外科 300456)

乳腺肿瘤；上皮-间质转化；侵袭；转移；综述

1982年Greenburg等[1]首次提出了上皮-间质转化(EMT)的概念，他们在细胞试验中证实上皮细胞会暂时失去极性，表现出间质细胞具有的迁移特性。研究人员将EMT依照其发生的生物学背景分为3种亚型。Ⅰ型EMT主要参与哺乳动物的胚层分化、器官形成及神经系统分化。Ⅱ型EMT主要参与创伤愈合、组织再生及器官纤维化[2]。Ⅲ型EMT与恶性肿瘤的发生发展密切相关，大量对人类癌症的研究已证实这点。原发肿瘤中的上皮样肿瘤细胞通过EMT的方式转变为转移性肿瘤细胞，并在某些情况下，再通过“间质-上皮转化(MET)”的方式在远处形成次级转移瘤[3]。EMT协同MET调节细胞可塑性，在肿瘤侵袭、转移及治疗抵抗方面扮演重要的角色。本文对乳腺癌EMT形成的相关影响因素及EMT形成对乳腺癌疾病演变及治疗影响的研究进展进行综述。

1 乳腺癌与EMT

已有大量研究证实肿瘤相关EMT的形成在小鼠和人类乳腺癌细胞系及实体瘤中确实存在，但这些在实验系统中建立的EMT模型，其临床相关性仍不明确。麻省总医院癌症中心Shyamala的最新研究描述了乳腺癌患者体内循环肿瘤细胞(CTCs)中EMT形成的特点，证实了EMT在人类乳腺癌的血液播散中起到了一定作用[4]。

EMT的形成受到多种因子调控，涉及多个信号转导通路及复杂的分子机制，与microRNA及肿瘤微环境等相关。最新研究发现，EMT的形成与lincRNA Hotair的表达增加及线粒体逆行信号通路相关[5-6]。在对乳腺癌及其他多种癌症的研究中发现，许多诱导Ⅲ型EMT形成的调控因素在Ⅰ型EMT中也发挥重要作用，表明在健康人当中不恰当的激活相关调控因素(如：转录因子Twist1、Six1、Snail1、LBX1及信号通路Wnt、TGF-β等)可形成Ⅲ型EMT，导致恶性肿瘤的发生和发展[7]。

1.1 EMT形成的相关调控因子 EMT形成的特点是上皮细胞标志物表达下调，如E-钙黏蛋白、闭合蛋白、紧密连接蛋白和桥粒斑蛋白等受到转录抑制，使细胞间黏附丧失。同时伴随间质细胞标志物表达上调，包括N-钙黏蛋白、细胞角蛋白、肌动蛋白和纤连蛋白等。E-钙黏蛋白为EMT发生的重要分子，与肿瘤的侵袭转移关系密切。有研究发现[8]，单纯破坏细胞间黏附并不能造成肿瘤细胞转移，而单独敲除CDH1(E-钙黏蛋白基因)造成E-钙黏蛋白表达缺失，可有效诱发EMT导致肿瘤细胞转移。转录因子Snail、Slug、ZEB1/ZEB2及Twist1/Twist2可直接作用于CDH1启动子上的E-boxs序列，抑制其转录，从而促进EMT形成。还有一类转录因子可通过间接抑制CDH1促进EMT发生，包括Six1、GSC及FOXC2等。在MCF7乳腺癌细胞系中，Six1通过激活TGF-β信号通路下调E-钙黏蛋白，诱发肿瘤相关EMT。GSC通过激活SNAI1/SNAI2及Twist1诱导Ⅲ型EMT形成。在对乳腺癌EMT形成机制的探索中，更多的作用于EMT形成的相关因子被发现。SOX4被发现在人乳腺癌临床标本中异常过表达，实验表明过表达SOX4使永生化人乳腺上皮细胞获得间质细胞特性，增强细胞迁移、侵袭能力，SOX4正调控已知EMT诱导因子表达，激活TGF-β信号通路，促进EMT形成[9]；最新研究报道，SOX4通过上调表观遗传修饰符Ezh2的表达促进EMT形成[10]。Huang等[11]研究发现，CCN6蛋白表达下调与乳腺癌细胞EMT形成相关，与乳腺癌腋下淋巴结转移相关。在乳腺癌细胞中稳定敲除CCN6，可通过激活IGF-1受体信号通路在RNA及蛋白水平上上调Snail及ZEB1表达，间接抑制E-钙黏蛋白等上皮细胞标记物表达，同时上调间质蛋白，从而诱导EMT形成。Zhao等[12]的研究表明ING5通过抑制PI3K/AKT信号传导通路，从而抑制乳腺癌细胞的EMT转换。有研究表明CPEB1通过调控MMP9 mRNA的表达从而影响乳腺癌细胞发生EMT，从而抑制了乳腺癌的转移。

1.2 EMT形成的主要信号通路 EMT形成通过精确的细胞内信号转导机制调控，多种细胞外信号通过与细胞表面的特异性受体结合，将信号传导到细胞内，通过相应的细胞内信号转导通路，激活相关转录因子调节基因表达，从而完成EMT。EMT的发生涉及多条信号通路，主要有：TGF-β、PI3K/AKT、Ras/MAKP、Wnt、Notch以及Hedgehog等信号通路。这些信号通路通过激活相关转录因子发挥作用，如：TGF-β可使Snai1/2、Twist1及ZEB1/2活化，还可上调FOXC2，从而诱导EMT形成。此外Notch、Hedgehog及Wnt通路通过激活Snai1/2作用于EMT。一些转录因子还可反作用于相关信号通路促进EMT发生，如：Six1可激活TGF-β和Wnt通路。TGF-β、经典及非经典Wnt3条信号通路协同作用可诱导细胞发生EMT，之后通过自分泌的方式维持间质细胞状态；研究人员证实在上皮细胞中下调内源性自分泌信号抑制因子可诱导细胞激活EMT程序；相反，在细胞中添加相关信号通路抑制剂破坏自分泌信号，发现原代乳腺上皮细胞迁移及自我更新能力受到抑制，并降低了转化衍生物诱导的肿瘤形成及转移。在对人类乳腺癌患者的最新研究证实了TGF-β介导上皮细胞向间质细胞转化，并观察到TGF-β为血小板来源。

1.3 MicroRNAs与EMT形成 研究发现miR-200家族等多种miRNA参与调控肿瘤EMT形成。在体外试验中miR-200家族可以抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的能力，还可通过下调ZEB1和ZEB2，增加E-钙黏蛋白表达，抑制EMT发生[13]。目前哈佛医学院Song等[14]的研究发现miR-22作为一种至关重要的表观遗传修饰符，在乳腺癌中促进EMT形成及干细胞特性的获得，促进癌症转移；试验中他们还发现在小鼠模型中miR-22可通过直接靶向起到肿瘤抑制作用的TET蛋白沉默对抗癌转移的miR-200。Cai等[15]研究发现，在体外及体内试验中，miR-374a在乳腺癌细胞系中的异常过表达可直接抑制多种Wnt/β-catenin信号级联反应的负调节蛋白，如：WIF1、PTEN和WNT5A，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，促进EMT发生。此外还有关于miR-145、miR-221/222等多种miRNA作用于肿瘤EMT的报道，它们通过不同的作用机制参与调控乳腺癌EMT过程，在其中发挥抑癌与促癌的双重作用[16-17]。

1.4 肿瘤微环境与EMT形成 肿瘤微环境是指在肿瘤细胞周围区域中与其相互作用的非肿瘤细胞与基质，包括细胞外基质、成纤维细胞、肌纤维母细胞以及免疫细胞等。随着肿瘤进展，肿瘤微环境可有效阻断来源于宿主的细胞毒信号，促进炎性反应，募集肿瘤浸润的淋巴细胞以适应宿主反应，这些肿瘤细胞、周围基质与炎症细胞间的相互应答，产生MMPs、ECM、生长因子及细胞因子等诱导局部组织重塑，导致EMT发生。最新研究发现，肿瘤微环境中的炎症因子TNF-α及IL-1β长期刺激癌旁的正常乳腺上皮细胞可导致其结构重塑及EMT形成，导致正常组织的恶变及疾病复发扩散。

2 EMT对乳腺癌预后及治疗的影响

2.1 EMT与乳腺癌侵袭转移 关于肿瘤侵袭转移的相关研究认为，在原发肿瘤侵袭转移的起始，癌细胞通过EMT获得间质细胞表型特征，穿透基底膜，发生内渗；在转移的终末，具有间质特性的肿瘤细胞通过MET重新获得上皮细胞特征，进而外渗发生微转移。在肿瘤相关EMT发生的过程中，癌细胞具有抗凋亡、免疫耐受、干细胞等特性，增加了肿瘤细胞侵袭转移能力。

2.1.1 EMT与细胞抗凋亡特性 细胞发生EMT后对一些因素导致的凋亡可产生一定的抵抗性。发生EMT的细胞可活化抗凋亡信号通路以及分泌抗凋亡因子。来源于不同哺乳动物的多种上皮细胞(如：NMuMG和KIM-2等)经诱导发生EMT后，对紫外线照射引起的细胞凋亡具有明显抵抗。EMT是抑制失巢凋亡的一个重要过程，在乳腺肿瘤发生模型中,E-钙黏蛋白的缺失参与抗失巢凋亡,促进血管形成,利于肿瘤转移扩散。有研究表明，EMT相关转录因子Snail在原发性乳腺癌和淋巴结阳性乳腺癌中过表达,它抑制E-钙黏蛋白基因的转录,并激活抗凋亡基因。有学者认为，细胞发生EMT的过程使得细胞暂时逃避了失巢凋亡反应的发生，而非细胞本身产生了抗凋亡特性，这一点更有可能是癌细胞不断增殖而不发生凋亡的原因。

2.1.2 EMT与乳腺癌干细胞特性 肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，称为肿瘤干细胞。乳腺癌干细胞的起源尚未完全明确，目前的研究认为可能来源于正常干/祖细胞的恶性转化。将乳腺癌患者胸腔积液中分离得到的乳腺癌干细胞移植到SCID小鼠的过程中，发挥了其致癌的能力。乳腺癌中CD44+/CD24-表型的细胞被认为是富集乳腺癌干细胞的细胞群，具有更强的侵袭和转移能力，对常规放化疗具有耐受性。

在人乳腺上皮细胞(HMECs)中，CD44+/CD24-细胞表现出与EMT相关的表型；通过TWIST1，SNAI1，TGF-β1等诱导肿瘤相关EMT形成，可导致CD44+/CD24-细胞和肿瘤形成升高，以上证明了EMT诱导物与肿瘤干细胞形成的因果关系[18]。Mani等[19]在体外试验中发现，在永生性人类乳腺上皮细胞中通过Twist或Snail转录因子诱导EMT发生，可使CD44+/CD24-肿瘤干细胞标记物表达增加；他们在进一步研究中首次报道了，在体外及体内试验中，EMT相关调控因子FOXC2在人类乳腺上皮细胞中异位表达足以引发EMT并使细胞获得干细胞样表型[20]。癌细胞发生EMT并获得干细胞特性后，其促进肿瘤形成的分子机制仍不十分明确。

2.1.3 EMT与免疫调节 有研究[21]证实，由转录因子Snail诱导的EMT可通过免疫抑制作用于肿瘤细胞转移，由Snail诱导形成典型EMT特征的鼠类和人类黑色素瘤细胞中，可部分通过血小板反应蛋白-1(TSP-1)产物诱导调节性T细胞和肿瘤组织中受损的树突状细胞抑制免疫反应。同时研究还发现Snail过表达的黑色素瘤细胞对免疫治疗不敏感，但在瘤内注射Snail基因特异性siRNA和抗TSP-1单克隆抗体后，即可刺激肿瘤浸润性淋巴细胞增生和全身免疫反应，从而抑制肿瘤的生长和转移。

2.2 EMT与乳腺癌治疗抵抗 化疗耐药是肿瘤治疗中的难题。最近的研究证据表明，在乳腺癌及其他多种癌症中EMT的形成与化疗耐药相关。这种EMT相关耐药表型不仅出现在对传统化疗药物(如：紫杉类、铂类、蒽环类)的耐药中，还出现在靶向药物及内分泌治疗药的耐药中。

有研究[22]表明，在阿霉素和紫杉醇及多西他赛耐药的MCF-7细胞系中，细胞获得间质表型特征，发生EMT过程，其中Slug表达上调，E-钙黏蛋白、闭合蛋白表达抑制，N-钙黏蛋白、波形蛋白表达激活，ER-α水平的下降可能与Slug表达上调相关；免疫组化结果显示，在耐药MCF-7细胞系中，ER和E-钙黏蛋白表达缺失，伴随波形蛋白高水平表达。同样的细胞系，在耐他莫昔芬情况下观察到，细胞在形态学上发生了EMT改变，耐药株出现波形蛋白和N-钙黏蛋白表达上调，β-连环蛋白酪氨酸磷酸化水平上调以及β-连环蛋白与E-钙黏蛋白结合的消失。Li等[23]研究发现，在乳腺癌MCF-7细胞系中，阿霉素可同时诱导细胞凋亡与EMT发生，而只有发生EMT过程的细胞表现出了多药耐药与高侵袭特性；高表达的Twist1被发现是这一过程的关键因素，将发生间质转化的MCF-7细胞用小分子干扰RNA技术敲除Twist基因，可以逆转细胞的多药耐药性，提高其对药物的反应性。以上研究证实了EMT的发生与多药耐药发生相关。

在体外试验中，正常细胞和肿瘤细胞诱导发生EMT后，对于药物的抵抗性均增加，可见这种耐药性的增加并非源于致瘤性转化；前面已提到EMT可赋予细胞干细胞特性，而试验也表明治疗抵抗的发生与无法消灭这种干细胞特性而造成新的肿瘤再生相关。那么，更为有效的治疗应同时关注于干细胞耐药及EMT的发生，逆转EMT使得细胞获得干性减弱可有效控制肿瘤，目前对于新治疗方法的探索已关注于EMT样细胞与肿瘤干细胞潜能获得。Asiedu等[24]研究发现，AXL上调可诱导EMT发生并调节乳腺癌干细胞功能，通过MP470下调AXL可逆转EMT，减弱乳腺癌干细胞自我更新能力并增加其化疗敏感性；若靶向AXL并联合系统治疗，则有潜力提高抗癌药物反应,减少乳腺癌复发和转移。

3 结 语

EMT是癌症病程中的一个关键事件，临床研究已证实其在人类乳腺癌血液传播中确实发挥作用。有研究表明[25]，用于晚期乳腺癌的抗癌新药恩替诺特(ENT)可通过增加E-钙黏蛋白表达活性，逆转EMT发生过程，降低癌症转移，这为癌症治疗提供了新的途径。但目前针对EMT的相关研究仍多数基于体外试验模型，对影响其发生的多种因素、复杂分子机制，以及EMT在癌症侵袭、转移和治疗耐药等方面的临床相关性仍需提供更多的证据。有研究从临床角度讨论了一些肿瘤细胞分化和转移的争论，提出证据表明某些上皮型癌细胞在整个转移过程中一直维持上皮形态[26]。因此，关于EMT的形成机制仍需进一步研究。这将有助于今后探索更为精确有效的乳腺癌靶向治疗方案。

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张彤(1973-)，本科，副主任医师，主要从事胸外科与胸腺外科方面的研究。

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