Clathrin在急性呼吸窘迫综合征中的研究进展*

刘俊彦 综述，李玉英审校

(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)



·综述·

Clathrin在急性呼吸窘迫综合征中的研究进展*

刘俊彦 综述，李玉英△审校

(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)

呼吸窘迫综合征，成人；危重病；Clathrin；中性粒细胞；巨噬细胞；肺水肿；急性呼吸窘迫综合征；综述

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭。其致病因素众多，发病机制复杂，至今尚未完全阐明。除致病因素对肺泡的直接损伤外，更重要的是多种炎症细胞及其释放的炎症介质和细胞因子对肺泡上皮和微血管的损伤。ARDS的主要病理生理特征为肺微血管通透性增加，肺泡内富含蛋白质的液体积聚，进而导致肺水肿和透明膜的形成，造成严重的通气/血流比例失调。近年来ARDS的分子发病机制逐渐成为研究热点，研究表明网格蛋白(Clathrin)在ARDS的发病及进展中扮演重要角色，现就其具体机制做一简要综述。

1　Clathrin的基本结构、功能

Clathrin是1976年在动物细胞中首次被发现的一种细胞极性相关的蛋白质，被称为网格蛋白。它是由3条重链和3条轻链构成的三脚架复合体，组成六边形或五边形的笼型结构，重链是三脚架结构的主要骨架，轻链用于调节Clathrin笼型结构的组装和拆卸。Clathrin是所有真核细胞蛋白质和脂类从质膜运载到胞内的主要工具,也是蛋白质和脂质从反式高尔基体网络(trans Golgi network,TGN)到核内体的载体。植物细胞中的Clathrin至今未被正式鉴定，但在拟南芥基因组中发现了类似动物Clathrin的编码基因[1]。Clathrin介导的内吞(Clathrin-mediated endocytosis,CME)广泛参与组织器官生长发育等生理、病理过程的信号转导。植物Clathrin在生长素输出载体活性亚基(PIN)蛋白介导的生长素的极性运输过程中具有重要的调控作用[1]。

2　Clathrin介导的细胞内吞作用

CME参与多种物质的入胞及胞内转运过程。Clathrin包被囊泡(Clathrin-coat vesicle，CCV)的形成主要经过以下步骤：(1)Clathrin包被小窝的成核化(nucleation of Clathrin-coatde pits)；(2)货物的捕获；(3)细胞膜内陷、凹窝缩溢；(4)囊泡剪切和去包被[2]。这一过程需要多种辅助蛋白的参与，如AP2、AP180、eps、endophilin、BAR、EFc/F-BAR蛋白家族成员、HSC70等。其中AP2(adapter protein)是一种重要的衔接蛋白，它能识别结合货物并将其募集到Clathrin、介导膜结合与定位和其他辅助蛋白(dynamin、auxilin、Eps15)相互作用、维持包被小窝的发育。Clathrin在ARDS的多种致病因素和多个病理环节中发挥重要作用。Clathrin不仅多方面参与介导白细胞和肺内巨噬细胞的生物学功能，还在各种炎症介质如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和包括转化生长因子β(TGF-β)在内的多种细胞因子诱导的信号通路中起重要调控作用。此外，Clathrin内吞调控Na,K-ATP酶、水通道蛋白，以及上皮细胞的黏附连接和紧密连接，在肺水肿液和蛋白的清除、肺水肿的恢复中也具有重要意义。阐明Clathrin在ARDS中的作用机制，将有助于进一步深化对ARDS的发病机制的理解，并对ARDS的临床治疗提供新的思路。

3　Clathrin与中性粒细胞激活

肺内多形核细胞(PMN)的产生是ARDS过度炎性反应的元凶。中性粒细胞触发呼吸爆发释放活性氧、大量炎性介质和细胞因子，导致肺泡上皮细胞和毛细血管内皮的损伤，引发肺水肿和气体交换障碍。(1)Clathrin参与E-选择素(E-selection)介导的白细胞的黏附。E-选择素是表达于活化血小板和血管内皮细胞一种介导炎性反应的重要分子，与其配体结合后介导白细胞在活化血管内皮上的滚动。白细胞结合E-选择素后，经Clathrin包被小窝迅速内吞。高渗环境孵育中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞或内皮细胞能够可逆的损伤Clathrin介导的E-选择素的内吞和支持白细胞滚动的能力。证明E-选择素与Clathrin包被小窝相互作用加强了白细胞的黏附[3]。(2)Clathrin介导中性粒细胞趋化受体的内吞。血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)是一种具有多功能生物活性的脂质介质，包括血小板的激活、白细胞活化、气道收缩和血管通透性增高。PAF受体需要Clathrin介导的内吞，募集β-arrestin-1和p38MAPK 信号小体实现其生物信号的转导[4]。其他可以作为配体经Clathrin介导内吞相应的中性粒细胞趋化受体，实现信号传导的方式的还有甲酰肽和白三烯B4。使用大量的CME药理抑制剂抑制Clathrin介导的内吞途径可能减弱或抑制PMN介导的急性肺损伤[5]。(3)Clathrin调节中性粒细胞过氧化物酶的产生。已知Clathrin能够介导G蛋白耦联受体的内吞[6]。花生四烯酸(leukotrienes B4，LTB4)是休克后肠系膜淋巴液中的一种炎性介质，作为G蛋白耦联受体的激动剂，促进中性粒细胞过氧化物的产生，与急性肺损伤的发展密切相关。高渗盐水通过抑制Clathrin介导的活化的G蛋白耦联受体内吞，弱化中性粒细胞的激活效应，减少中性粒细胞过氧化物酶的产生，可能有助于减轻ARDS[7]。

4　Clathrin与肺内巨噬细胞

肺内巨噬细胞是ARDS的始动环节之一。(1)肺泡巨噬细胞的吞噬作用需要Clathrin包被小窝相关蛋白。用脂质体转染Clathrin抗体和AP2进入鼠肺泡巨噬细胞抑制了酵母聚糖外壳和致敏红细胞的内吞作用；金刚烷胺(Clathrin抑制剂)能够抑制Clathrin包被囊泡的出芽，抑制上述物质的内吞，证明肺泡巨噬细胞的吞噬作用需要Clathrin介导的受体/膜成分的循环。在J774A.1巨噬细胞，可以通过松弛素D和MDC(Clathrin抑制剂)阻断Clathrin介导的内吞作用而抑制吞噬作用和大胞饮[8]。(2)Clathrin介导CD163-L1的内化。CD163-L1属于富含半胱氨酸蛋白家族的B组清道夫受体，当单核细胞被巨噬细胞集落刺激因子激活变成巨噬细胞时，CD163-L1的表达增加。CD163-L1的功能是作为一种或多种配体的清道夫受体，可能在促炎症消退中发挥一定作用。促炎介质IL-4、IL-13、TNF-α和脂多糖(LPS)/干扰素γ(IFN-γ)能抑制CD163-L1的表达，CD163-L1是一种内吞受体，其表达的下降可能是由于Clathrin介导的内吞[9]。(3)Clathrin/dynamin协助LPS介导的TRAM-TRIF信号通路。Toll样受体(Toll like receptor,TLR)是广泛分布在免疫细胞尤其是非特异免疫细胞及某些体细胞表面的一类模式识别受体。其中TLR4信号系统是清除细菌、预防致死性肺损伤和菌血症的关键。TRL4识别LPS,激活TRAM-TRIF依赖的局部信号通路并启动LPS的内化。使用MDC、dynamin抑制剂(DS)、核内体酸化成熟抑制剂(CQ)使巨噬细胞内吞功能紊乱。结果显示，MDC和DS不但影响LPS的内化，还减少了细胞因子和趋化因子的释放和TRAM-TRIF介导的信号分子的激活[10]。

5　Clathrin与肺水肿

5.1肺泡内液体的转运ARDS的特征是肺泡内富含蛋白水肿液的积聚，因此肺泡内液体和蛋白的清除成为肺水肿恢复的关键。(1)Clathrin介导Na,K-ATP酶的内吞。肺泡上皮细胞顶端膜的Na+通道和基底膜外侧膜的Na,K-ATP酶的活动在肺泡液体的清除中发挥重要作用。在肺损伤中所见的Na,K-ATP酶功能的降低是由于其从细胞质膜进入细胞内池被降解造成的。低氧和活性氧刺激，导致Na,K-ATP酶 α亚基磷酸化触发内吞是一种Clathrin-AP2依赖的过程[11]。(2)Clathrin是水通道蛋白的载体。水通道蛋白(AQPs)是位于细胞膜上的转运蛋白，目前人体的发现的AQPs有13种，其中AQP1、3、4、5表达于肺组织中。目前还未有关于Clathrin与AQP1、3、5关系的报道，但有研究发现在犬肾上皮细胞(MDCK细胞)内以酪氨酸为基础的基底外侧膜的分选信号通过与AP2复合体的μ亚基直接作用，决定AQP4 Clathrin介导的内吞[12]；Clathrin介导AQP2在主细胞基底膜的运输[13]；肾集合管中的AQP2定位于Clathrin包被小窝，通过降低Clathrin介导内吞的辅助蛋白(dynamin)的活性可以抑制AQP的内吞[14-15]。根据以上报道推测肺内AQPs的表达也与Clathrin有关，但仍欠缺有力的证据支持。(3)Clathrin调节上皮细胞的紧密连接和黏附连接。ARDS中上皮细胞及内皮细胞屏障功能破坏，水、离子及各种分子的转运失衡。黏附连接(AJs)和紧密连接(TJs)是调节上皮极性和屏障功能的关键。闭合蛋白(claudins)被认为是TJ结构中的关键蛋白，其中claudin-1、claudin-5肽的衍生物，分别位于上皮细胞和内皮细胞。claudin-1、claudin-5肽的摄取绝大多数是经由Clathrin介导的[16]。Clathrin介导E-钙黏蛋白的动态循环。E-钙黏蛋白是上皮细胞黏附功能的中心组成成分，也在上皮的生长和极性的建立中发挥重要作用，当细胞外信号活动破坏黏附连接时，E-钙黏蛋白通过Clathrin进入细胞。敲除Clathrin重链造成E-钙黏蛋白极性的部分缺失。锚定蛋白(Ankyrin-G)和Clathrin协同控制E-钙黏蛋白的内化[17]。此外，有研究发现T84细胞的其他AJs和 TJs蛋白(p120、β-catenins、occludin、JAM-1、claudins-1、claudins-4及ZO-1)的内吞也经Clathrin介导。

5.2肺泡水肿液蛋白的转运ARDS肺泡水肿液中的蛋白大部分是来源于毛细血管渗漏的清蛋白。培养的Ⅱ型肺泡上皮细胞对清蛋白的摄取是通过Clathrin介导的内吞实现的[18]。在A549细胞中，肺部给药多聚-L-鸟氨酸(Poly-L-ornithine,PLO)后，PLO可以与FITC-清蛋白共同孵化，使清蛋白在细胞表面的结合和摄取明显增强，促进肺水肿的恢复。该效应在存在Clathrin抑制剂时被明显减弱[19]。已知Clathrin介导清蛋白的内吞，PLO促进清蛋白的吸收机制未见相关研究报道，其是否与Clathrin内吞的增强有关还有待进一步探索。

6　Clathrin与各细胞因子

ARDS的发生机制涉及各种炎症细胞的激活、炎症介质的释放、信号通路的启动和细胞因子的产生，如活化的中性粒细胞释放弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶、TNF、IL等，肺内巨噬细胞分泌TNF、IL、PAF等形成细胞因子网络，通过多种信号途径调节炎性反应的发生[20]，已证实其中某些物质和信号通路与Clathrin密切相关。(1)TNF-α诱发的炎症信号需要Clathrin重链。TNF-α是介导ARDS的主要细胞因子，它不仅能够诱导血管内皮的活化、白细胞迁移，还能与其他细胞因子如IL-1协同激活肺部炎性细胞的核转录因子κB(NF-κB)，诱导炎症的级联反应，使细胞表面的黏附分子表达增加。TNF受体1(TNFR1)募集多种激酶，最终使IκBα磷酸化，磷酸化的IκBα降解释放活性NF-κB,其中多种受体需要Clathrin介导的内吞。敲除人类肺泡上皮细胞Clathrin重链，导致Iκα和P65磷酸化作用均显著减弱，同时单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的产生也降低。关于TNF受体2(TNFR2)的内吞途径尚未完全知晓，但在TNFR2的细胞膜内结构中鉴定出的二亮氨酸基团证明Clathrin介导TNFR2的内吞[21]，表明Clathrin参与TNF-α诱导的炎症信号通路。(2)IL-1β的内化涉及Clathrin介导的内吞。IL-1β为一种致炎细胞因子，激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路，诱导相关炎症因子的表达，广泛参与了人体组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程。IL-1与受体绑定结合组成IL-1RⅠ和配体蛋白IL-1RAc实现其细胞效应。此外IL-1与 IL-1RⅡ绑定结合使信号缺失的功能称为诱饵效应。IL-1的内化是由诱饵受体(IL-1RⅡ)特异介导的，内化需要消耗ATP且涉及Clathrin的内吞作用[22]。(3)Clathrin介导内吞调节TGF-β信号通路，参与维持生长、发育和组织稳态[23]。ARDS的终末阶段是肺纤维化的发生。TGF-β1 是一个涉及多种器官的纤维化的关键细胞因子，通过与丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合物结合诱导Smad2和Smad3磷酸化实现信号通路的转导，Clathrin与TGF-β受体的内吞和降解都密切相关，通过调节Clathrin的功能，能够实现对Smad信号通路及TGF-β生物学作用的调控。使用Clathrin依赖的内吞受体(dynamin)抑制剂，可以抑制TGF-β受体内化和Smad2/3的磷酸化[24]。抑制Clathrin介导的内吞， TGF-βSmad信号通路被明显抑制[25-26]。此外，Clathrin介导内吞参与调控溶酶体途径的TGF-β受体的降解[27]。Clathrin内化TGF-β受体是否参与了ARDS终末期肺纤维化的发生还需要更多的依据。(4)除了上述介绍的LTB4外，PAF、内毒素、IL-18也都是通过G蛋白耦联受体介导信号传导[5]，在炎症过程中起着重要作用。

7　Clathrin参与肺泡膜磷脂代谢和自噬

肺表面活性物质结合蛋白(surfactant-associated protein A,SP-A)是反映Ⅱ型肺泡上皮细胞功能的早期指标和预后标准，SP-A含量下降可作为ARDS高危患者预警[28]。SP-A具有多种生物学功能，如参与肺泡表面活性物质(PS)的形成及代谢；作为自身调节因子稳定细胞内外PS的水平；限制血浆蛋白渗漏入肺泡腔，参与局部防御；调节肺泡巨噬细胞的功能，促进其趋化活性和氧自由基的产生等。相对于补体和免疫球蛋白，SP-A在肺泡内含量较多，对肺部炎症的调节具有重要意义。肺泡腔内SP-A清除的主要途径是由Ⅱ型肺泡上皮细胞经Clathrin介导的内吞重摄取，摄取的SP-A部分进入板层小体，再与新合成的SP-A共同分泌进入肺泡腔[29]；还有部分与受体结合，经Clathrin介导被巨噬细胞摄取降解[30]。有研究发现，Clathrin与细胞自噬有关。禽流感病毒H5N1感染的患者通常患有严重的肺炎，病情迅速进展，最终发展成ARDS、呼吸衰竭。实验证明，H5N1假性病毒颗粒的血凝素(HA)不仅诱导促炎细胞因子和趋化因子的产生，也引发了A549细胞和小鼠肺组织细胞自噬。自噬介导的炎性反应涉及NF-κB和p38MAPK信号通路的激活，需要Clathrin的参与[31]。

8　总　　结

Clathrin不仅涉及ARDS病理过程的多个环节，更广泛参与人体多种生理过程，尚未发现参与全身和(或)肺部炎性反应的Clathrin存在，因此靶向治疗的可行性还有待鉴定。目前已发现多种Clathrin介导内吞抑制剂，虽然部分体外细胞培养和动物实验中发现调节Clathrin的功能对于ARDS或炎性反应过程有一定的影响，但缺乏相关临床实验依据，故Clathrin抑制剂在ARDS的作用机制有待进一步深入研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.038

国家自然科学基金资助项目(81070052)。作者简介：刘俊彦(1990-)，在读硕士，主要从事急性呼吸窘迫综合征研究。△

，E-mail:lzhlyyhy@163.com。

R563.8

A

1671-8348(2016)14-1981-04

2015-11-15

2016-02-29)