黄花芥蓝染色体制片优化及核型分析

夏 雪，辜金花，刘丹，吴益梅，田玉肖，陈 清，张 芬，汤浩茹，孙 勃

（四川农业大学园艺学院，成都611130）

黄花芥蓝染色体制片优化及核型分析

夏 雪，辜金花，刘丹，吴益梅，田玉肖，陈 清，张 芬，汤浩茹，孙 勃*

（四川农业大学园艺学院，成都611130）

以黄花芥蓝典型品种“福州黄花”为材料，对影响染色体制片效果的取材时间点、预处理时间和解离时间等条件进行优化，并进行核型分析.结果表明:上午9:00取材，分裂相细胞和中期分裂相细胞最多；0.002 mol/L 8-羟基喹啉预处理5 h染色体收缩性最好，形态最佳，分散性好；1 mol/L HCl 60℃解离8 min细胞分散，染色体着色良好而细胞质透明，对比度高.黄花芥蓝的染色体数目为2n=2x=18，染色体相对长度变化范围为9.66%～14.29%，染色体长度比为1.48，其染色体类型包括长染色体（large chromosomes，L）、中长染色体（middle chromosomes 2，M2）和中短染色体（middle chromosomes 1，M1），染色体相对长度组成为2L+2M2+14 M1，着丝粒指数变化范围为27.86%～48.19%，臂比值变化范围为1.08～2.59，其中第1、4、6、9对染色体为近中部着丝粒染色体（submetacentric chromosomes，sm），其余5对为中部着丝粒染色体（metacentric chromosomes，m），第6对染色体具有随体（satellites，SAT），核型不对称系数为61.95%，核型分类标准属2A型.同时，本研究还比较了黄花芥蓝与已报道的白花芥蓝的核型结果，发现两者在核型公式、染色体长度比和相对长度范围等方面存在明显差异.研究结果丰富了对芥蓝遗传组成的认知，为芥蓝分类地位与种内亲缘关系研究提供细胞学证据.

黄花芥蓝；染色体；制片优化；核型分析

SummaryChinese kale（Brassica alboglabra Bailey）is an original Chinese vegetable belonging to the Brassicaceae family of cruciferae.It is commonly grown for its bolting stems and tender rosette leaves as the edible parts，which are tender and crisp.Chinese kale contains large amounts of health-promoting compounds，such as vitamin C，carotenoids，total phenolics，and glucosinolates.It is widely distributed in Guangdong，Fujian and Guangxi Provinces.

The typical yellow-flower Chinese kale cultivar“Fuzhou-Huanghua”was used as the plant material，the ____chromosome staining factors，including sampling time point，pretreatment and dissociation duration，wereoptimized.Karyotype characteristics were also investigated，and then the obtained results were compared with those from the reported white-flower Chinese kale so as to reveal the karyotype differences.

The seeds of“Fuzhou-Huanghua”were soaked for 2 hours，and then cultured in dark in petri dishes with moist filter paper at 25℃for 3 days.The root tips were excised between 8:00—10:00 AM，with 30 min intervals to determine the optimum sampling time point；pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline were conducted for 1- 10 h（1，2.5，5，7.5 and 10 h，respectively），subsequently，the root tips were macerated in 1 mol/L hydrochloric acid at 60℃for 1- 16 min（1，4，8，12 and 16 min，respectively）.Thirty cells with clear metaphase chromosomes were selected，and then the numbers and karyotype analysis of chromosomes were done by the cytological standards.

The results showed that the percentage of the mitotic cells and metaphase cells reached maximum when sampled at 9:00 AM；the best contraction，shape and dispersion of chromosomes were found at 5-h pretreatment with 0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline；the best cell dispersion，chromosome staining and cytoplasm transparency，as well as the highest contrast ratio were observed at 8-min dissociation.Yellow-flower Chinese kale has a total of 18 chromosomes.The chromosome types included large chromosomes（L），middle chromosomes 2（M2），middle chromosomes 1（M1），and the constitution of the relative length was 2 L+2M2+14 M1.The centromeric index ranged from 27.86%to 48.19%，and the arm ratio ranked from 1.08 to 2.59.There were four pairs（the first，forth，sixth and ninth chromosome）of submetacentric chromosomes（sm）and five pairs（number two，three，five，seven and eight chromosome）of metacentric chromosomes（m），while the two satellites（SAT）were observed at the sixth pair of chromosomes.The karyotype formula was 2n=2x=18=10m+8sm（2SAT）.Karyotype asymmetry index（As.K）was 61.95%，and karyotype characteristics fell into type 2A according to STEBBINS classification criteria.Meanwhile，significant differences in karyotype formula，ratio of chromosome length（L/S），and range of chromosome relative length were observed when comparing the chromosome characteristics between yellow-flower and the reported white-flower Chinese kale.Specifically，compared with the above results，four m and five sm chromosomes were reported in six white-flower cultivars.Moreover，the ratio of chromosome length（L/S）in yellow-flower Chinese kale（1.48）was lower than that in white-flower Chinese kale cultivars（1.50- 1.71），which is mainly due to the fact that the shortest chromosome relative length in yellow-flower Chinese kale（9.66%）was obviously higher than that in white-flower ones.However，no significant difference was observed in arm ratio range，As.K or satellite position between the two types.

In conclusion，the optimized chromosome preparation conditions and karyotype analysis of yellow-flower Chinese kale were revealed.These results will enrich the awareness of genetic composition of Chinese kale，and provide cytological evidence for the study on the taxonomic status and phylogenetic relationship of these taxa.

芥蓝（Brassica alboglabra Bailey）起源于中国的十字花科芸薹属蔬菜，主要以肥嫩的花薹及其嫩叶作为食用部分，其质地脆嫩，营养丰富，含有维生素C、类胡萝卜素、多酚和芥子油苷等多种营养成分［13］，主要分布在我国广东、福建和广西等省区. BAILEY［4］对获得的白花芥蓝进行观察，发现与其他甘蓝类植物花色为黄色不同，据此将芥蓝定为一个种.后来的研究人员从杂交亲和性、同工酶、染色体核型等多个角度进行了较为系统的研究，从而形成了关于芥蓝与甘蓝分类关系的2种观点，一种认为芥蓝是独立于甘蓝的种［45］，另一种认为芥蓝属于甘蓝的变种［69］.

除白花芥蓝外，黄花芥蓝也是芥蓝的一种重要类型，2种类型在花色、产地、生物学特性和营养品质等方面存在显著差异［2，10］，但关于两者关系的研究还鲜有报道.核型分析作为一种重要的细胞学研究手段，广泛地应用于物种发育进化及物种间亲缘关系的研究中［1112］.截至目前，研究人员对多个白花芥蓝品种的核型进行了分析［6，9，1314］，但关于黄花芥蓝的核型还尚未见报道.本试验以黄花芥蓝典型品种为材料，首先对其染色体制片的关键步骤进行条件优化，之后采用最佳制片条件进行黄花芥蓝的核型分析，并与已报道的白花芥蓝核型结果进行比较，进而揭示黄花芥蓝与白花芥蓝的染色体核型差异，以期为芥蓝分类地位与种内亲缘关系研究提供细胞学证据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试芥蓝为产自福建的典型黄花品种“福州黄花”（Brassica alboglabra cv.Fuzhou-Huanghua）.

1.2 方法

本试验于2014年9—11月间在四川农业大学园艺学院遗传育种实验室进行.以黄花芥蓝根尖为材料，挑选籽粒饱满的黄花芥蓝种子在室温下浸种2 h，之后放入铺有双层湿润滤纸的培养皿中25℃恒温暗培养3 d，当根尖长度至10～15 mm时，每30 min为1个时间间隔，剪取上午8:00—10:00的芥蓝根尖，以确定最适的时间点进行取材；4℃条件下以0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液分别预处理1 h、2.5 h、5 h、7.5 h和10 h，以确定最优预处理时间.将预处理好的材料置于卡诺固定液（冰醋酸∶无水乙醇=1∶3）4℃固定24 h，之后分别用95%、85%和75%的乙醇溶液梯度洗脱，最后保存在75%的乙醇溶液中.解离采用酸解法，将保存好的根尖用1 mol/L HCl 60℃下分别解离1 min、4 min、8 min、12 min和16 min，以确定最优解离时间.之后用蒸馏水清洗3次，切取黄花芥蓝根尖分生区部分于载玻片上，卡宝品红染液染色5～10 min，常规压片后镜检，将装片中染色体形态及分散良好的中期分裂相细胞在Olympus CX21显微镜100倍油镜下观察并拍照.

选取30个染色体数目清晰的中期分裂相细胞进行染色体计数，核型分析采用李懋学，等［11］提出的标准进行，确定着丝粒位置，根据染色体的大小和形态特征对染色体核型进行配对分析，染色体的相对长度、臂比及类型按照LEVAN，等［15］的命名法则计算，着丝粒指数和染色体相对长度系数参照李懋学，等［11］的标准计算，核型不对称系数采用ARANO［16］方法计算，核型类型按照STEBBINS［17］的标准划分.

2 结果与分析

2.1 染色体制片的优化

2.1.1 取材时间点对分裂相细胞数的影响

我们对不同取材时间点黄花芥蓝根尖分裂相细胞数和中期分裂相细胞数进行了计数与统计.由图1可见，不同取材时间点分裂相细胞百分比和中期分裂相细胞百分比存在显著差异.上午9:00取材的分裂相细胞百分比高达52.16%，显著高于其他时间点，其次是上午9:30，分裂相比例也超过40%，而上午10:00、8:30和8:00间比例最低且无显著差异，统计结果均不足上午9:00的一半.中期分裂相细胞百分比统计结果与分裂相细胞百分比结果趋势基本一致，上午9:00比例最高，为2.51%.综合分裂相和中期分裂相细胞统计结果，上午9:00取材可以观察到的分裂相和中期分裂相细胞最多，最易筛选出分散良好的染色体分裂相.因此，上午9:00是观察黄花芥蓝染色体的最佳取材时间点，后续的研究也均采用该时间点作为取材时刻.

图1 黄花芥蓝不同取材时间点分裂相细胞和中期分裂相细胞的百分比Fig.1 Percentage of cells at the mitotic and metaphase stage in yellow-flower Chinese kale under different sampling time points

2.1.2 预处理时间对制片效果的影响

不同预处理时间（解离时间为8 min）对黄花芥蓝染色体制片效果存在明显影响.结果（图2）表明，预处理1 h，染色体固缩程度明显不足，且拖尾现象严重，同时染色体聚为一团，分散性差（图2A）；预处理2.5 h，染色体分散程度略有改善，但仍不理想，同时染色体形态不佳，多呈长棒状，着丝粒不明显（图2B）；预处理5 h，染色体收缩性最好，形态最佳，均呈现“X”型，着丝粒清晰可见，同时分散性很好（图2C）；预处理7.5 h，染色体分散性好，但部分染色体收缩过度呈点状，已不适合用于核型分析（图2D）；预处理10 h，染色体最为分散，但大多染色体都收缩过度，着丝粒不明显，只适合染色体计数（图2E）.综上，预处理5 h的染色体最适合用于黄花芥蓝染色体的核型分析.

图2 不同预处理时间处理后的黄花芥蓝染色体图Fig.2 Chromosomes of yellow-flower Chinese kale under different pretreatment time

2.1.3 解离时间对制片效果的影响

不同解离时间对黄花芥蓝染色体制片效果也存在明显的影响.在60℃下1 mol/L HCl解离8 min，细胞间较为分散，染色体着色良好而细胞质趋于透明，对比度高，解离效果最佳（图3C）；解离1 min和4 min，解离不够充分，细胞不易分散，细胞内部的染色体也很难分散，外部细胞染色体和细胞质均着色很深，对比度低，而内部细胞由于接触不到染液而无法着色，导致染色体不易进行观察和分析（图3A，B）；当解离12 min和16 min，解离程度逐渐过度，虽然细胞比较分散且细胞质不被染色，但细胞中的染色体同样也不易着色，从而导致染色体颜色太浅，不易进行后续的观察和分析（图3D，E）.因此，我们选择8 min作为后续试验的解离时间.

图3 不同解离时间处理后的黄花芥蓝染色体图Fig.3 Chromosomes of yellow-flower Chinese kale under different dissociation time

2.2 核型分析

选择30个染色体分散良好的细胞进行观察计数，结果表明所有细胞的染色体均为18条，占计数细胞的100%，从而确定黄花芥蓝的染色体数目为2n=2x=18.图4显示黄花芥蓝各染色体清晰可见，均呈“X”型，且着丝粒明显，其中2条染色体具有随体.核型分析的结果见表1，黄花芥蓝染色体绝对长度变化范围为3.92～5.80μm，平均绝对长度为4.51μm，染色体相对长度变化范围为9.66%～14.29%；染色体相对长度系数变化范围为0.87～1.29，其染色体相对长度组成为2L+2M2+14M1，其中L、M2和M1分别代表长染色体（large chromosomes）、中长染色体（middle chromosomes 2）和中短染色体（middle chromosomes 1）；着丝粒指数变化范围为27.86%～48.19%，臂比值变化范围为1.08～2.59，其中第1、4、6、9对染色体为近中部着丝粒染色体（submetacentric chromosomes，sm），其余5对为中部着丝粒染色体（metacentric chromosomes，m），第6对染色体具有随体.核型公式为2n=2x= 18=10m+8sm（2SAT），其中SAT代表随体（satellites），染色体长度比为1.48，臂比值大于2∶1的染色体占总染色体的33.33%，根据STEBBINS的核型分类标准，黄花芥蓝的核型属2A型，核型不对称系数为61.95%.其核型模式图如图5所示.

表1 黄花芥蓝染色体核型参数Table1 Karyotype parameters of chromosome of yellow-flower Chinese kale

图4 黄花芥蓝根尖染色体中期分裂相与核型图Fig.4 Metaphase chromosomes and karyotype of yellow-flower Chinese kale root tips

3 讨论

图5 黄花芥蓝染色体核型模式图Fig.5 Chromosome idiogram of yellow-flower Chinese kale

甘蓝类蔬菜的染色体多为小染色体类型，且相邻染色体形态又非常相似［18］，因此本试验首先针对取材时间点、预处理时间和解离时间等因素进行优化，筛选到了黄花芥蓝的最佳染色体制片条件.植物旺盛分裂期一般出现在上午期间，为获得更多的分裂相，研究人员通常将取材时间点设在上午，如黄瓜在上午8:40—9:10取材最佳［19］，百里香在上午9:00取材最佳［20］，本试验中黄花芥蓝的最佳取材时间点为上午9:00，与黄瓜和百里香等植物基本相同.但不同物种的细胞分裂旺盛期存在一定差异，如甜瓜和玉米等在上午8:00取材最佳［2122］.通过预处理环节可以获得更多的中期分裂相细胞；同时还能改变细胞质的黏度，促使染色体收缩与分散，因此，预处理是染色体制片过程中的关键环节.不同预处理溶液作用有所不同，研究表明8-羟基喹啉处理能使染色体及缢痕显示清晰，通常适合染色体较大的植物［23］，但在不同植物中效果可能会有所不同.甘蓝类蔬菜的染色体一般较小，张红梅，等［18］对青花菜进行条件优化时发现，相比秋水仙素、对二氯苯和冰水等预处理溶液，8-羟基喹啉处理2.5 h效果最好，其他研究人员进行包括白花芥蓝在内的甘蓝类蔬菜核型分析时也多采用8-羟基喹啉进行预处理2～2.5 h［9，1314］.因此本研究也采用8-羟基喹啉进行处理并对预处理时间进行了分析，结果表明5 h效果最佳，造成时间差异的原因可能是由于物种不同导致的.迄今为止，黄花芥蓝的核型分析尚未见报道，作为芥蓝的一个重要类型，其最佳预处理时间可能与白花芥蓝及其他甘蓝类蔬菜有所不同.解离也是影响制片效果的一项重要因素，其目的是分解和软化细胞壁，使细胞间易于分离，同时清除部分细胞质，使细胞质背景透明化，便于染色体的观察.本试验发现，解离时间短，压片时细胞不易分散，细胞染色体和细胞质着色对比度低，不易观察；解离时间过长，则较难染色，这与前人的研究结果一致［20，24］.

黄花芥蓝与白花芥蓝作为芥蓝的2种重要类型，在表型、农艺性状、营养品质等方面存在明显差异［2，10］，本试验对黄花芥蓝典型品种“福州黄花”的核型进行了分析，同时对4篇文献中6个品种的白花芥蓝核型进行归纳整理［6，9，1314］，之后对黄花芥蓝与白花芥蓝的核型差异进行了比较（表2）.结果表明，黄花芥蓝与白花芥蓝在核型公式、染色体长度比和相对长度范围等方面存在明显差异，这些差异可能与表型差异有关.已报道的6个白花芥蓝品种单套染色体组中均有4条中部着丝粒染色体（m）和5条近中部着丝粒染色体（sm），而黄花芥蓝正好相反；白花芥蓝的染色体长度比范围为1.50～1.71，均明显高于黄花芥蓝，这主要是由于黄花芥蓝的最短染色体相对长度（9.66%）明显高于白花芥蓝（8.05%～9.16%），而黄花芥蓝的臂比值范围和核型不对称系数与白花芥蓝无明显差异.通常同一种中的随体数量和位置是相对稳定的，但同一种的不同变种、不同类型及不同品种间其随体的数目、位置和形态等可能存在不同程度的变异.研究表明，6个白花芥蓝品种均为1对随体，但所处位置在第5、6、7对染色体上均有报道［6，9，1314］.本试验中黄花芥蓝与白花芥蓝一样，仅有1对随体，随体位于第6对染色体上.甘蓝类蔬菜在世界各地广泛栽培，具有很强的遗传多样性，而地理环境及人工选择因素可能导致其不同变种、不同类型及不同品种在遗传组成及核型方面形成较大差异［9］，这可能也是黄花芥蓝与白花芥蓝核型存在差异的主要原因.同时我们也会在今后的研究中分析更多品种的黄花芥蓝，以便更为准确地反映黄花芥蓝与白花芥蓝的核型差异.

表2 黄花芥蓝与已报道的白花芥蓝核型差异比较Table2 Differences of chromosome karyotype between yellow-flower Chinese kale and reported white-flower Chinese kale

本试验对“福州黄花”芥蓝的染色体制片条件进行了优化，取材最佳时间点为上午9:00，0.002 mol/L 8-羟基喹啉预处理最佳时间为5 h，1 mol/L HCl 60℃解离最佳时间为8 min，条件优化结果为黄花芥蓝的核型分析、原位杂交及分子标记等研究提供了基础.同时本试验还揭示了黄花芥蓝的核型特征，并与已报道的白花芥蓝核型进行比较，从染色体水平上分析了黄花芥蓝与白花芥蓝的差异，丰富了人们对芥蓝遗传组成的认知，为芥蓝分类地位、种的进化、种内亲缘关系、遗传多样性研究及育种工作提供了参考.

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XIA Xue，GU Jinhua，LIU Dan，WU Yimei，TIAN Yuxiao，CHEN Qing，ZHANG Fen，TANG Haoru，SUN Bo*
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

yellow-flower Chinese kale；chromosome；preparation optimization；karyotype analysis

Q 243；S 635

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2015.06.061

国家自然科学基金（31500247）；四川省教育厅重点项目（14ZA0016）；四川省省级大学生创新训练计划项目（201410626036；201510626060）；四川农业大学本科质量工程项目（04052109）；四川农业大学本科教学改革研究项目（X2015020）.

*通信作者（Corresponding author）:孙勃（http://orcid.org/0000-0003-3306-656X），Tel:+86- 835- 2882293，E-mail:14099@sicau. edu.cn

联系方式:夏雪（http://orcid.org/0000-0003-0617-8419），E-mail:1033587510@qq.com

（Received）:2015- 06- 06；接受日期（Accepted）:2015- 11- 19；

日期（Published online）:2016- 09- 18

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160918.1609.026.html