色谱-质谱联用技术在中药代谢组学研究中的应用

贾孟琪，薛　芸，王　彦，熊野娟，阎　超*

(1.上海交通大学　药学院，上海　200240；2.上海健康医学院，上海　201318)



色谱-质谱联用技术在中药代谢组学研究中的应用

贾孟琪1，薛芸1，王彦1，熊野娟2*，阎超1*

(1.上海交通大学药学院，上海200240；2.上海健康医学院，上海201318)

摘要：代谢组学是研究生物体被扰动后其代谢产物种类、数量及变化规律的科学，研究理念与中医药理论的整体、动态观念非常一致，目前很多工作已将代谢组学应用于中药药效物质基础、作用机制、复方及配伍规律等研究中，有望推动中医药现代化进程。色谱-质谱联用技术是代谢组学的主要分析技术平台，该文综述了近3年来色谱-质谱联用技术在中药代谢组学研究中的应用，重点介绍不同分离技术的特点及最新进展，并讨论了其存在的问题。

关键词：色谱；质谱；中药；代谢组学；综述

传统中医药和天然产物在中国已有两千多年的使用历史，在预防和治疗疾病方面发挥了重要作用。但是因为中药理论体系难以科学定义，且中药多为复方使用，在体内作用靶点多，涉及多个基因和生化通路，众多因素均制约了中药的迅速发展，引发了中药质量标准化、中药安全、活性成分分析及其作用机制研究等多方面的问题[1]。因此，在依赖飞速发展的药学、分析化学、生物学等技术的基础上，建立一座连接传统医学和现代科学的桥梁是中药现代化的必然趋势[2]。

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学等之后现代系统生物学的研究热点[3]，是研究生物体被扰动后(如基因的改变或环境变化)其代谢产物(内源性代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学[4]，建立在分子生物学基础之上，并通过结合大规模信息提取技术和多元变量处理技术[5]揭示系统内部各组成成分相互作用和运行规律。代谢组学的研究观念与中医药理论的“整体观、动态观、辨证观”相吻合[6]，见微知著，将其应用于中药研究有望为中药现代化提供一种新的途径和思路。

代谢组学研究平台主要由分析技术平台和数据分析平台两部分构成。常用的分析技术包括光谱、色谱、核磁共振谱、质谱[7]等，由于中药代谢组学样品中未知化合物种类多、组成复杂、代谢物浓度差异大，能够同时满足高灵敏度、高分辨率、高通量和无选择性的代谢物分析平台难以实现。Wishart等[8]认为当前的任何单一分析技术只能获得比例少于五分之一的整体代谢物信息，若要实现普适性和选择性的有机结合，需要多种分析技术互补[9]。色谱-质谱联用技术将色谱卓越的分离能力和质谱准确的定性定量优势相结合，符合现代中药代谢组学分析的要求，已成为目前应用最广泛的技术。

本文通过近3年的典型实例，综述了色谱-质谱联用技术在中药代谢组学研究中的应用情况，重点讨论了不同种类联用技术在中药代谢组学研究应用中的特点及其最新进展，以期为中药现代化研究提供新思路。

1气相色谱-质谱联用(GC-MS)

气相色谱(GC)主要是利用被分析物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离，具有分离效率高、灵敏度高、通量高等特点[10]，但对于色谱峰不能直接给出定性结果，必须与已知标准物质的色谱图进行对照，有一定的局限性。而GC-MS联用技术扩大了其应用范围，已经成为较成熟的技术。质谱检测器具有强大的结构鉴定能力，精密度较高，一般情况下可检测到10-11~10-13g的痕量物质，并且有相应的化学物质标准图库[11-12]。常用的GC-MS联用仪有气相色谱-三重四极杆质谱仪(GC-TSQ/MS)、气相色谱-离子阱串联质谱仪(GC-IT/MS)、气相色谱-飞行时间质谱仪(GC-TOF/MS)、全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(GC×GC-TOF/MS)等。GC-MS联用技术取长补短，使样品分离、鉴定和定量一次快速完成，对批量物质的整体和动态分析有很大的促进作用，尤其是在中药代谢组学研究应用方面[13]。

GC-MS联用技术常采用多级非线性升温法，在中药代谢分析中多用于挥发性成分如脂肪族、芳香类、萜类等化合物的测定[14]，但对沸点高、极性强、热稳定性差甚至易挥发的物质需经过一定处理才能进样。尤其是生物样本中大量含有羟基、羧基等官能团，在联用时，也受到质谱质量检测范围的限制[15]。耿放等[16]运用代谢组学方法探讨中药逍遥散对急性肝损伤的保护作用机理，利用N-甲基-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA)对血清进行柱前衍生化处理，GC-MS进样分析，发现血清中12种与空白对照组有明显差异的代谢物，需进一步研究。该方法需要保证吹干残渣中水分，且加入三甲基氯硅烷(TMCS)确保衍生反应完全。Wang等[17]用顶空固相萃取(HS-SPDE)法处理灌胃中药龙湖片的大鼠血浆生物样本，GC-TSQ/MS技术测量其中左旋薄荷脑、龙脑、异龙脑以及代谢物樟脑挥等挥发性成分的含量，结果证明，相比液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)，HS-SPDE能更有效地避免血浆中中药挥发性成分的损失，又可降低共提物引起的噪音，定量下限降低30~100倍。在中药植物代谢产物中，很多糖类、有机酸类、氨基酸类化合物的衍生物有类似的质谱图，仅依靠质谱数据库方式检索对化合物的定性无法排除噪音、包埋或重叠峰现象，所得结果准确度不高，还需要通过计算保留指数辅助定性[18]。Zhou等[19]用GC-MS结合保留指数技术检测正常大鼠与黄连给药大鼠的血清及组织代谢差异，经过质谱定性分析及多变量统计处理，鉴定出醋酸、丙氨酸、甘氨酸等8种化合物是腹泻副作用的潜在标志物，推测是由于其打破肠道微生物群的平衡从而引发腹泻症状，通过代谢组学研究揭示了中药副作用的诱发原因，为中药安全临床应用提供了有力支持。类似的，Wang等[20]用GC-TSQ/MS技术对高血脂模型大鼠进行代谢轮廓分析，在其肝脏组织和血浆中鉴定出23种脂肪酸类代谢产物，以及5种高血脂疾病组与正常大鼠的差异代谢物，并用蔓性植物中药七叶胆与阿伐他汀治疗大鼠，发现两种药物均能使大鼠功能逐渐恢复正常，研究结果推测中药七叶胆(GP)主要影响大鼠的花生四烯酸及磷脂酰胆碱代谢通路，与西药阿伐他汀的作用机制不同。

中药作为复合体系，化学成分复杂，传统一维色谱由于峰容量低、峰重叠的原因，几乎不能实现全组分的准确定性定量[21]，而多维色谱理论上可以有效提高系统峰容量和分辨率。1991年Philips等[22]提出全二维气相色谱法(GC×GC)，通过一个调制器将分离机制不同而又相互独立的两根色谱柱串联，经第一根GC柱分离后每一个色谱峰调制器都捕集、聚焦，以脉冲方式再传送到第二根GC柱进一步分离。GC×GC的最大峰容量近似等于两根色谱柱各自色谱峰容量的乘积[23]。该方法通过改变极性和温度来实现系统正交性[24]，在此基础上可以有效利用分离空间，具有瓦片效应、族分离、分辨率高等特点。飞行时间质谱检测器(TOF/MS)的扫描速度达≥100次/s，具有强大的反卷积功能，能提供未知物的精确质量数[25]，是目前代谢组学研究最能够充分发挥二维气相色谱联用优势的检测器，尤其适合代谢组学研究。

本课题组[26]基于GC×GC-TOF/MS联用分析平台，研究了中药木香挥发油活性成分治疗下的MCF-7乳腺癌异源移植裸鼠模型的血清和尿液代谢物，结果发现GC-TOF/MS分析血液获得551个色谱峰，而GC×GC-TOF/MS分析尿液检测到2 564个色谱峰(见图1)。图1中X轴、Y轴分别代表第一维和第二维的保留时间，Z轴代表质谱响应强度，将三维图中Z轴方向的响应强度向保留时间平面投影，得到可视化二维图。经过多维数据处理和标准质谱数据库定性，GC×GC-TOF/MS最终获得72个差异代谢物，涉及不饱和脂肪酸等5条代谢通路，并进一步筛选出7个潜在乳腺癌病理标志物，为中药治疗异源乳腺癌的作用机制研究及其治疗评价奠定了基础。此研究反映出GC×GC-TOF/MS不仅具有快速扫描、峰容量大、强大的信息采集能力，并且有效提高了光谱纯度，灵敏度是一维气相色谱的多倍，对中药代谢样本等复杂体系全组分分析具有非常重要的意义。

2液相色谱-质谱联用(LC-MS)

液相色谱(LC)是目前中药代谢组学应用最广泛的分离技术，能够分离极性的、离子化的、不易挥发和热不稳定的化合物，并且具有分离效率高、选择性好的特点。与GC相比，LC不需考虑样品的挥发性和热稳定性，不需要高柱温即可进行样本分析。与MS联用时，省去了复杂的衍生化等前处理过程，集LC高分离效能与MS强鉴定能力于一体，可直接对样本进行预处理、分离及富集，同时给出其结构信息。该方法分析快速方便，具有其它分析方法不能比拟的优点[27-29]。Liang等[30]建立了液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(HPLC-IT-TOF/MSn)分析赤芍水煎液在大鼠体内吸收及代谢成分的分析方法，检测及鉴定出未见报道的13个吸收成分及90个代谢产物，并进一步研究了芍药苷、儿茶酸、没食子酸等几种活性成分的生物活性。该研究首先结合母体化合物、代谢物数据库初步筛选吸收成分，之后利用多级质谱、中性丢失碎片特征匹配、化合物脂水分配系数差异综合的方法鉴定未知代谢物，提出了一种新型的中药吸收成分及代谢物的研究方案，具有借鉴意义。Deng等[31]利用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF/MS)法测定老鼠粪便，前处理方法简单，可准确定性出66种金石蚕苷代谢产物，揭示了金石蚕苷在体内的主要代谢途径及碎裂方式。

显而易见，目前仅用单个或者一级质谱远达不到中药代谢样本的分析要求，相同或者不同的质谱串联，是中药代谢成分结构鉴定和定量分析的热点。串联质谱是在一级质谱的基础上，根据离子碎片获得更全面的化学结构信息，同时也可为定量提供更好的选择性和灵敏度，常见的串联质谱有三重四极杆(TSQ)、四极杆线性离子阱(Q-Trap)、组合型离子阱轨道阱质谱仪(LTQ Orbitrap)、四极杆飞行时间(Q-TOF)、离子阱飞行时间(IT-TOF)等。表1综述了液相色谱-质谱联用技术在中草药化学成分及其代谢产物研究中的应用，并比较了常用串联质谱的优缺点和适用方向[11，32]。

表1　常用串联质谱的优缺点对比

同样，二维液相色谱-质谱联用(2DLC-MS)因采用多重机理分离复杂组分，可以有效提高系统分辨率及峰容量等，被大量应用于中药代谢组学研究。二维液相色谱有很多不同种类的分离模式，常见的有正相色谱(NPC)、反相色谱(RPC)、离子交换色谱(IEC)、亲水相互作用色谱(HILIC)等。从实际操作来看，分为在线二维色谱和离线二维色谱。由于操作简便和可重复性，在线二维色谱发展较为深入，在线“中心切割”(Heart-cutting)二维色谱(LC-LC)是指将一维目标组分收集进入第二维色谱中分离，而在线全二维液相色谱(LC×LC)则是将一维色谱的所有组分按照比例有序地间隔导入第二维色谱中分析，适合中药代谢复杂样品和未知组分分析。

中药中存在大量不同种类的微量组分，往往经过体内代谢后起到关键的药效作用。Qiao等[33]首先利用中心切割技术从中药葛根提取物中去除5种主要组分，之后结合RP×RP-2DLC分析了剩余微量组分，最终采用质谱定性了12种物质，其中9种化合物为首次在葛根中发现。该研究所应用的中心切割技术结合全二维液相色谱(HC-2DLC-MS)系统为解决中药代谢中微量组分的分析问题提供了新思路。

虽然以相同分离模式为基础的LC×LC比LC的峰容量更大、分辨率更高，更好地解决了二维系统溶剂不相溶等问题，但由于LC×LC的系统正交性差，限制了其更深入的发展。理论上二维色谱的正交性越好，可拓宽分离窗口的能力越高[34]。正交性主要由二维色谱柱固定相的分离机理决定，因此有研究通过结合不同种类的固定相[35]来建立二维液相色谱系统，但研究结果表明，二维固定相种类的选择只有结合流动相pH值及二维梯度洗脱程序等因素才能对二维液相色谱分析起到优化作用[36]。Qiao等[37]利用甲醇和乙腈为流动相溶剂的不同选择性，同步程序洗脱第一维和第二维色谱，将较为常用的RP×RP-2DLC系统正交性提高至79.8%，并成功用于中药白花蛇舌草的研究。此外为了减少第一维色谱柱选择性单一的限制，Li等[38]利用强阴离子交换色谱柱(SAX)和氟苯基色谱柱(PFP)混合色谱模式作为第一维，反相C18色谱柱作为第二维分离，建立了SAX-SAX-PFP×C18在线切换二维(多维)液相色谱系统(见图2)，并用于中药半枝莲和七星莲的分析，发现该平台对于中药非极性到极性的物质均有很好的分离效果，但由于PFP的强疏水作用，导致分析时间较长，最终优化确定SAX-CN×C18的二维分析体系。该方法对于分析生物样本中中药原药成分及极性代谢产物均有优势，具有一定的借鉴意义。

为了解决高效液相色谱分析时间长、分离效率低等问题，超高效液相色谱(UPLC)逐渐得到发展。UPLC基于HPLC原理，以亚二微米小颗粒、超高柱效的填料为核心技术，具有分离度高、分析速度快、灵敏度高、选择性不变等优点[39]。UPLC-MS技术结合化学计量学方法为中药代谢组学用于疾病的潜在标志物筛选及中药作用机制研究提供了新的技术平台[40]。Liu等[41]用UPLC-MS技术以及多变量统计分析方法研究了动脉粥样硬化代谢紊乱兔子模型尿样代谢物，采用正交偏最小二乘法分析对照组及动脉粥样硬化模型组兔代谢物差异显著的物质，得到15种潜在标志物，并对中药和西药治疗组进行整体疗效评价，同时结合标志物进行相应的通路解释，为中药心可舒治疗评价及潜在机制研究提供了新方法。Geng等[42]利用UPLC-Q-TOF-MS技术进行中药仙灵骨葆在大鼠体液(包括血浆、尿液、胆汁)的代谢轮廓分析，很大程度上缩短了分析时间，提高了分离度，一次进样20 min内可得到147种代谢产物(见图3)。可以预见，UPLC-MS技术未来将在复杂生物样本的分离分析尤其是中药代谢组学的研究中发挥更大的作用。

图2　综合全二维液相色谱系统方案[38]

图3　生物样本中仙灵骨葆相关-外源性物质的提取离子图[42]

3毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)

毛细管电泳(CE)又称HPCE，是新型微分离技术，具有分离效率高、操作简便快速、样品用量少、易微型化等[43]优点。CE可以通过改变操作模式和缓冲液成分[44]，分离极性非常广泛的物质，尤其适用于中药复杂成分及其代谢组分的分析，如生物碱、黄酮、苷类、香豆素类、有机酸类、多肽类及蛋白质类等化合物的分离分析[45-47]，成为GC和LC的有力补充。而CE-MS技术联用，可对纳升级别样品进行分子量的准确测定和结构解析。

Liu等[48]建立了毛细管电泳-纳喷雾-质谱联用技术对中药黄连的多种有效成分进行分析，与MS联用时使用无鞘流接口技术以及高灵敏度的多孔喷雾器，并优化各项参数。与UPLC-MS法的分析结果进行对比，发现CE-MS的灵敏度及重现性更为出色，且方法检出限与超高效液相色谱相当。毫无疑问，此方法为稀有中药及其生物代谢样本的分析打开了崭新局面。

4存在的问题

由于中药样本本身的复杂性和未知性，中药代谢组学目前仍处于不断发展的过程中，色谱-质谱联用技术在该领域的应用研究仍存在很多亟待解决的问题。

首先面临的问题是从包含大量生物基质的代谢样本中，将中药原药成分及其相关代谢物分离开来。由于中药被机体吸收后，经过Ⅰ相代谢及Ⅱ相代谢，化学结构改变，极性增加，导致代谢物在一般的反相色谱柱上吸附过强，色谱峰拖尾严重，影响测定结果，而如何与亲水作用色谱柱或者其它方法建立有效的二维(多维)联用系统，以达到快速分离极性范围较广、分子量差异大，甚至同分异构、同素异形等的常量、微量代谢物集合，还需要更高效、更有针对性的方法及仪器平台。

除了分离检测中药相关代谢物之外，未知成分的定性也是中药代谢组学的研究重点。GC-MS联用[49]在此方面颇具优势，有标准代谢物谱库可供检索，能够方便准确地用于代谢物物质的定性，但缺点在于气相色谱样本前处理复杂，检测对象局限性大；而LC-MS可检测范围较广泛，分子量相对较大的代谢物[50]，但需要依赖对照品。因此完善和充实已有代谢数据库中的代谢物数量，并建立相对统一规范的液质图谱数据库(尤其是针对中药代谢物图谱数据库)将是中药代谢组学发展的巨大挑战。

此外，中药代谢样本检测得到的原始数据需要进行预处理，尽管色谱-质谱联用提高了检测的分离度和峰容量，但对于复杂代谢样本，峰重叠、假阳性峰干扰等现象依然大量存在。目前常用的数据处理软件如ChromaTOF等虽具有一定的检测复杂峰及解卷积功能，但依然不能令人满意，尤其是二维色谱-质谱联用的数据转化与处理问题。而数据预处理之后结合化学计量学“简化和降维”等方法大部分适用于线性数据集，如何吸收借鉴数学和统计学方法，并从非线性数据中有效提取代谢物的变化规律也是中药代谢组学需要努力的方向。

5展望

综上所述，色谱-质谱联用技术是中药代谢组学研究强有力的工具，能更好地帮助阐释中药药效物质基础、作用机制、复方及配伍规律，为中药安全合理用药及新药创新提供技术平台和科学依据，与化学计量学的有机结合也使中药代谢研究的应用越来越广泛。随着各种联用技术的发展，数据处理功能软件的进一步更新，以及代谢数据库的建立与完善，中药代谢组学将大力推动中医药的现代化进程，并成为今后中药的研究热点。

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Applications of Chromatography-Mass Spectrometry in Traditional Chinese Medicine Metabonomics

JIA Meng-qi1，XUE Yun1，WANG Yan1，XIONG Ye-juan2*,YAN Chao1*

(1.School of Pharmacy,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai200240,China；2.Shanghai University of Medicine & Health Sciences,Shanghai201318,China)

Abstract：Metabonomics (metabolomics)is a subject branch that focuses on the dynamic changes of molecular mass metabolites in complex samples of an organism.Its research concept is consistent with the holistic view and dynamic state view of Traditional Chinese Medicine (TCM).Therefore,metabonomics has been widely applied in research on TCM,and chromatography-mass spectrometry has become the main analytical technique of metabonomics.Therefore,the applications of chromatography-mass spectrometry in TCM metabonomics are reviewed, the advantages and disadvantages of different separation techniques are discussed,and the latest developments of TCM metabonomics in the past three years are emphasized.

Key words：chromatography；mass spectrometry；traditional Chinese medicine；metabonomics；review

中图分类号：O657.63；TQ460.72

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)02-0172-07

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.007

*通讯作者：熊野娟，研究方向：药物分析技术，Tel:021-33755573,E-mail:xyj7411@yahoo.com.cn

基金项目：上海市教育委员会科研创新项目(14YZ170)

收稿日期：2015-08-31；修回日期：2015-10-29

阎超，博士，教授，研究方向：微电动分离技术、激光检测及药物分析，Tel:021-34205673，E-mail:chaoyan@unimicrotech.com