肝细胞癌免疫治疗的现状与挑战

曲建慧，张翠红，李若然，陆荫英

·导向与述评·

肝细胞癌免疫治疗的现状与挑战

曲建慧，张翠红，李若然，陆荫英

免疫疗法是目前肿瘤治疗的一种新方法，应用前景广阔，在治疗相关毒性和疗效方面较传统疗法均具有明显优势。免疫检查点抑制、克服肿瘤免疫逃逸和重建抗肿瘤免疫机制是肿瘤免疫治疗的关键。在肝细胞癌中，免疫治疗尚处于初级阶段，免疫治疗单独或联合其他治疗方法可能有利于控制肿瘤进展，但总体疗效仍然有限。本文结合免疫治疗在肿瘤中的研究和应用进展，分析了肝细胞癌免疫治疗研究现状以及面临的挑战。

癌， 肝细胞；免疫系统；免疫疗法

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率在世界上位居恶性肿瘤的第五位，在肿瘤相关死亡原因中位列第三位［1-2］。经HCC早期治疗预后较好，5年生存率大于70%。但由于缺乏有效的筛查机制和早期诊断方法，我国大多数HCC患者发现时已经处于中晚期，失去根治性治疗的机会。加之HCC对传统放疗、化疗均不敏感，目前用于HCC治疗的靶向药物索拉非尼客观有效率仅为3.3%，临床有效率也仅为30.0%左右［3-4］。近十年来HCC的治疗几乎未取得任何实质性的突破，迫切须要探索新的治疗方法。

基于HCC发生的病理机制，免疫治疗被认为是HCC治疗的潜在有效方法。某些治疗方法如经导管动脉化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization， TACE）、射频消融（radiofrequency ablation， RFA）等也能够诱导机体抗肿瘤应答，为临床上免疫联合局部治疗HCC提供了依据［5-6］。多种免疫效应机制能够靶向肿瘤细胞，包括细胞因子、多肽疫苗、单克隆抗体以及细胞介导的疫苗都可以成为激发抗肿瘤免疫应答的潜在治疗方法，而且在治疗相关毒性和疗效方面，免疫治疗都具有其独到的优势。

1 HCC的免疫缺陷

肝脏的长期慢性炎症诱导了HCC的发生，其中HBV和HCV慢性感染是HCC发生的主要危险因素，其他因素包括肥胖、糖尿病、酒精性和非酒精性脂肪肝以及其他慢性肝脏疾病。大多数患者从慢性肝炎、肝硬化最终发展成HCC是一个动态发展过程，其中肿瘤特异性细胞免疫和体液免疫应答贯穿着HCC的发生发展过程。在HCC患者体内存在着针对多种肿瘤抗原如 AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican 3， GPC3）、纽约食管鳞癌蛋白-1 （New York esophageal squamous cell carcinoma-1，NY-ESO-1）、滑膜肉瘤X断裂点基因-2（synovial sarcoma x breakpoint-2， SSX-2）、黑色素瘤相关抗原 A （melanoma-associated antigen-A， MAGE-A）10和 P53的自发性T细胞免疫应答［7-13］。但是，由于肿瘤自身调节的多种免疫抑制机制的存在，导致这些T细胞应答并不能抑制肿瘤的进展。首先，正常参与免疫应答的分子，例如主要组织相容性抗原（major histocompatibility antigen， MHC），其作用在肿瘤中常常出现下调，导致肿瘤抗原呈递障碍。共刺激分子B7-1和B7-2在HCC中的表达也是减少的，在缺乏共刺激分子的作用下，MHCⅡ类分子诱导了CD4+T 细胞的无应答，可导致肿瘤发生免疫逃逸［14］。最终，免疫抑制性淋巴细胞数量升高、NK细胞功能抑制以及免疫检查点上调使HCC细胞免疫应答的效应功能受损［15-17］。

免疫抑制细胞，如调节性T细胞（regulatory T cells， Tregs）与骨髓来源的抑制细胞（myeloidderived suppressor cells， MDSCs）是免疫逃逸发生的关键细胞。HCC患者外周血和肿瘤组织中Tregs细胞数量增加［18］。 MDSCs是骨髓来源的一群异质性细胞，是树突状细胞（dendritic cells， DCs）、巨噬细胞和/或粒细胞的前体，具有显著抑制免疫细胞应答的能力，能够抑制NK细胞的细胞毒作用和CD4+、CD8+T细胞的获得性免疫应答，促进Tregs细胞扩增，诱导程序性死亡配体-1（progressed death-ligand 1， PD-L1）分子表达，抑制抗原提呈。而肝癌患者的外周血、脾脏、骨髓以及肝脏可见MDSCs汇集。最近，在HCC患者中发现一种调节性DCs细胞，体外能够产生IL-10，从而抑制T细胞活性。另外，多种免疫关键点分子，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T-lymphocyteassociated antigen 4，CTLA-4）、PD-L1在肿瘤微环境中常常出现过表达［19-20］。

因此，克服HCC的体液免疫和细胞免疫缺陷，提高机体抗肿瘤免疫应答，是HCC治疗领域一直探索和寻求解决的问题。

2 HCC免疫治疗的分类

传统的免疫治疗包括疫苗治疗和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells ， CIKs）治疗。而在过去十年中，随着对肿瘤生物学认识的加深和生物技术的发展，对肿瘤产生免疫逃逸的关键决定分子——免疫检查点分子的识别，全基因组测序对特异性分子变异的快速检测，为肿瘤免疫治疗提供了可用的分子靶点。基因治疗技术的发展，使体外基因修饰的或外源性的基因能够转导到体内肿瘤细胞，以再次激发免疫应答。上述主要进展改变了既往肿瘤免疫治疗的格局。

2.1 细胞因子治疗 IFN能够抑制慢性HBV、 HCV相关HCC的发生以及HCC的复发。IFN-α通过增强淋巴细胞增生、肿瘤抗原提呈和细胞毒反应诱导机体抗肿瘤应答，能够阻断或延缓根治性切除或消融术后HCC复发［21-22］，有效延长进展期HCC生存期，延缓肿瘤进展［23］。IFN-α也可以与化疗药物如顺铂、5-FU联合用于进展期肝癌［24］。IFN-γ能够诱导HCC细胞凋亡，与5-FU联合用于具有门静脉侵犯的HCC患者，其完全应答率为16%，部分应答率为36%［25］。但是目前对于IFN在HCC中的使用尚存在争议［26］，还不能作为HCC的常规治疗。IL-2作为免疫刺激因子，在免疫系统中具有重要功能，在多种肿瘤，尤其在黑色素瘤和肾细胞癌中具有抗肿瘤作用。

2.2 疫苗治疗 肿瘤疫苗治疗的目的是诱导肿瘤特异性免疫应答，利用效应性T细胞特异性降低肿瘤负荷，诱导免疫记忆，控制肿瘤复发。疫苗治疗主要针对肿瘤相关抗原（tumor associated antigens， TAAs）或者肿瘤新生抗原。TAAs是在肿瘤细胞中特异性表达、发生突变或异常表达的抗原，能被后天免疫系统识别，可以应用于免疫治疗的新方法中。肿瘤特异性CD8+T细胞在肿瘤的控制中起着十分重要的作用，这些特异性的T细胞可以识别TAAs中8～11个氨基酸肽链，并与MHC Ⅰ类复合物相关。TAAs可作为特异性人源单克隆抗体的靶点或用于设计人源化或嵌合单克隆抗体。肿瘤靶向抗体包括淋巴瘤中的利妥昔单抗（CD20），乳腺癌中的曲妥珠单抗（HER2/neu），转移性结直肠癌和肺癌中的贝伐单抗（VEGFA），以及转移性结直肠癌和进展期头颈部癌中的西妥昔单抗（EGFR）已经被证实有效并且目前已部分应用于治疗。

在HCC的免疫治疗中，某些TAAs已经被作为治疗靶点。AFP是HCC特异性抗原，作为潜在的肝癌肿瘤特异性抗原已被充分研究。然而在现已报道的几种基于AFP的免疫治疗方案中，并没有发现十分有效的临床获益［27-28］。GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白多糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族一员，通过糖基磷脂酰肌醇附着于细胞表面。GPC3不仅具有肿瘤特异性，而且在细胞增殖的过程中起着一定作用。因此，GPC3成为治疗HCC的一个较有希望的靶点。在早期肝癌国际指南中，GPC3可作为血清标志物结合免疫组化染色用于HCC早期诊断。多个临床研究已证实多肽疫苗以及GPC3靶向抗体免疫治疗的可行性［29］，表明GPC3多肽疫苗可作为全新的免疫治疗方法应用于HCC患者中，有提高总生存期的可能。

其他TAAs，如MAGE-A1 、MAGE-A3 、NYESO-1在HCC患者中过表达率分别约为65%、70%和45%［30］，并且都有很高的免疫原性，可能成为疫苗靶点，但尚缺乏在肝癌治疗方面的临床研究。

DCs细胞接种是HCC免疫治疗的较好方法［31］。肿瘤环境中，由于IL-6、VEGF、IL-10等细胞因子的释放，使DCs细胞活性受到抑制。通过体外活化DCs细胞、体内刺激DCs细胞成熟以及肿瘤相关抗原优化等策略，DCs疫苗能够启动强的针对TAAs的细胞毒性T淋巴细胞应答，诱导肿瘤细胞死亡。DCs细胞接种也可以联合其他治疗方式如TACE或分子靶向治疗，提高抗肿瘤治疗疗效。DCs疫苗联合酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼也可能会提高疗效［32］。在异源性造血干细胞移植的免疫应答中，DCs细胞接种取得了安全而且令人鼓舞的结果［33］。在肝癌行肝移植治疗的患者中，其有望有效控制肿瘤高复发率并改善预后，但还须要临床研究进一步证实。总之，从目前的临床研究结果来看，DCs疫苗治疗安全性比较高，但是其整体临床疗效尚不满意并有待提高。

2.3 细胞治疗 过继细胞治疗（adoptive cell therapy， ACT）是利用肿瘤患者自身具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，在体外扩增后再回输人体。ACT对多种类型的肿瘤治疗有效，例如黑色素瘤、肾细胞癌和神经母细胞瘤［30，34-35］。目前常用于肿瘤患者的ACT包括：CIKs、DCs细胞以及肿瘤浸润的淋巴细胞和基因修饰的T细胞。

CIKs是在体外使用多种细胞因子（如IFN-γ、IL-1、IL-2）和抗CD3抗体共同培养人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC），细胞中包含活化的NKG2DhighT细胞、活化NK细胞和NK T细胞。CIKs细胞易于活跃增殖并大量获得，不须依赖TCR-MHCⅠ类分子相互作用而对多数肿瘤细胞都有杀伤活性。在一项肝癌切除治疗的随机对照研究中，IL-2与抗CD3刺激PBMC作为术后辅助治疗，发现肿瘤的复发率降低了41%［36］。RFA后序贯ACT治疗也能降低HCC的复发［37］。Kamiya等［38］应用K562-mb15-41BBL细胞系刺激健康供者的外周血细胞，获得大量活化扩增的NK细胞，并且发现通过这种方法扩增的NK细胞比IL-2活化的NK细胞对HCC细胞系具有更明显的细胞毒作用，能够明显降低免疫缺陷荷瘤鼠的肿瘤生长，提高生存时间。这种扩增活化的NK细胞在临床HCC患者中的应用尚须进一步研究。

在基于DCs细胞的HCC免疫治疗中，刺激DCs细胞的方法有多种。使用AFP多肽刺激的DCs细胞治疗的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，疾病控制率达到28%［39］。另外还有使用肿瘤裂解液刺激DCs细胞，部分应答率达到10%。OK432，一种来源于链球菌的抗肿瘤免疫治疗药物，在肝癌的TACE治疗中或治疗后导入肿瘤组织［40］，较对照组表现了较长的无瘤生存期。

肿瘤浸润性淋巴细胞，是从肿瘤的手术标本中分离出的浸润淋巴细胞，用抗CD3抗体培养扩增后可产生几十亿细胞回输给患者，与IL-2同时注入可以促进T细胞的生长。一项肿瘤浸润淋巴细胞治疗转移性黑色素瘤的数据显示，48%患者获得总体应答，13%获得持久完全应答［41］。

随着生物技术的不断发展，以嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor， CAR）为基础的免疫治疗已被证明成为治疗恶性肿瘤的有效手段之一。CAR 的作用原理是利用基因工程技术，以非MHC限制性的方式识别目标抗原的嵌合受体，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力。使用CAR-T细胞治疗恶性肿瘤有多重优势：靶抗原的非人白细胞抗原（human leukocyte antigen， HLA）依赖，对多数患者具有广泛适应性，可以规避肿瘤逃逸并能短时间内扩增肿瘤特异的T细胞群。CAR-T细胞技术在血液系统恶性肿瘤治疗中已有了成功应用，如何将该技术用于实体瘤的治疗尚待进一步研究。该技术不但须要稳定产生肿瘤靶向的T细胞，还须要克服抵抗肿瘤微环境中免疫效应分子对CAR-T细胞的抑制和对其凋亡的诱导，调动内在抗肿瘤反应的功能。利用CAR-T细胞来激活内源抗肿瘤反应（如：TILs、NK细胞、先天免疫系统）也是重要的研究方向。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都是关键的决定因素。理想的目标抗原是仅在肿瘤细胞表面表达的肿瘤特异性抗原，但是肿瘤细胞表达的大多数抗原不具备肿瘤特异性，因此大多数的CAR都以TAAs作为靶点，往往会有“脱靶”的可能。现阶段常用的靶点除CD19以外，也有相关报道以ERRB2（雌激素受体β2）、HER-2/neu治疗肺部和前列腺癌，针对前列腺特异性抗原治疗前列腺癌、碳酸酐酶-IX （carbonic anhydrase-IX， CAIX）治疗肾细胞癌，Lewis Y治疗肺癌和卵巢癌等。近年来，CAR-T细胞在实体瘤的治疗上也显示了广阔的前景。在治疗淋巴瘤的临床试验中，使用CD20特异性CAR-T细胞表现出了良好的抗肿瘤活性和耐受性［42］。由于肝癌细胞相对缺乏肿瘤特异性抗原，限制了CAR-T细胞在肝癌治疗中的研究和使用。2014年，上海交通大学和第二军医大学的研究人员开发了GPC3特异性CAR-T细胞［43］，评估了GPC3-特异性CAR-T细胞对HCC的治疗作用，发现GPC3靶向CAR-T细胞能够有效消除GPC3阳性HCC细胞，从而为GPC3阳性HCC提供了一种很有前途的治疗方法。另外，在某些实体瘤中，TAAs特异性CAR-T细胞治疗表现出比较严重的毒副反应，可能是由于TAAs在正常组织中也存在低水平表达。这也一定程度上限制了这种治疗技术的临床使用。

2.4 免疫检查点抑制剂 免疫检查点是共抑制分子，能干扰免疫应答，避免T细胞过度活化和组织损伤。主要成员包括CTLA-4、PD-1，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3，淋巴细胞活化基因（lymphocyte activation gene， LAG）-3及B和T淋巴细胞弱化子（B and T lymphocyte attenuator， BTLA）。

抗-CTLA-4能够阻断CTLA-4对效应性T细胞和Tregs细胞的作用，发挥抗肿瘤活性。2种抗-CTLA-4单克隆抗体在某些肿瘤，如黑色素瘤中的使用已经表现出作用。Ipilimumab是抗-CTLA-4单克隆抗体，可以明显延长转移性黑色素瘤的生存时间（治疗与未治疗患者的2年生存率分别为18%和5%）［44］；替西木单抗是另外一种抗-CTLA-4单克隆抗体，与CTLA-4结合可以阻止其与B7配体相结合，从而抑制B7-CTLA-4所介导的T细胞活性下降。替西木单抗也是第一个在慢性HCV感染相关HCC患者中进行临床验证的关键点阻断单克隆抗体［45］。研究发现替西木单抗可以抑制HCV相关的晚期肝癌进展。该研究纳入了21例晚期肝癌患者，给药方式为每90 d接受15 mg/kg静脉注射1次，每例患者约接受2个疗程治疗。其中2名患者出现了肿瘤缩小，11例患者肿瘤稳定超过1年。平均肿瘤进展时间接近7个月。免疫检查点抑制剂在肝癌中的应用值得进一步探讨。

PD-1是T细胞应答的潜在抑制子，阻断PD-1分子成为HCC的一种治疗选择。Nivolumab是一种完全人类IgG4单克隆抗体PD-1抑制剂，在转移性黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌中的应答率分别为28%、27%和18%［46］。2015年5月，在第51届美国肿瘤学会年会上［47］，公布了一项有关nivolumab的临床Ⅰ/Ⅱ期研究结果，表明nivolumab治疗晚期肝癌是安全有效的。47例有效患者12个月的总存活率为62%，25%的患者出现部分应答或完全应答，更重要的是，有4例患者应答超过12个月。研究数据令人振奋，提示免疫检查点抑制剂介导免疫治疗在肝癌治疗中的有效性，但是尚需要更大型的临床研究验证。

2.5 免疫联合治疗 免疫治疗可以联合使用于肿瘤的治疗，例如免疫检查点PD-1与CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和LAG-3抑制剂的联合使用等，在HCC中的应用也将会有更多的研究报道。另外，免疫治疗也能够与外科手术、局部治疗和分子靶向治疗等联合使用，进一步激发抗肿瘤免疫。单独化疗对肿瘤不一定有效，但是化疗可以诱导肿瘤细胞死亡，阻断肿瘤诱导的免疫逃逸［48］，例如降低免疫抑制细胞如MDSCs和Tregs的数量，因此可以作为免疫治疗的辅助治疗。在结肠癌肝转移模型中，Oxaliplatin联合腺病毒介导的肝内IL-12表达明显提高了抗肿瘤应答反应。酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼联合免疫治疗是否有效目前还不明确。

3 免疫治疗面临的挑战和前景

免疫治疗是目前进展期肿瘤最有前景的治疗策略之一，但是仍然面临种种挑战。首先，免疫治疗缺乏有效的疗效预测分子标志物，不能很好地确定哪些患者能从治疗中受益；另外，虽然几种免疫治疗均表现了其可行性和安全性，但其抗肿瘤活性尚不充分，联合其他免疫治疗或传统的化疗、放疗等方法，可能会增加对免疫治疗的应答，因此须要研究哪种联合治疗方案更为有效。另外一个亟须解决的重要问题是肿瘤对免疫治疗的疗效目前很难评估，还没有标准用以充分评估免疫治疗的疗效。由于免疫治疗的疗效滞后，目前既有的2种HCC应答评估工具：实体瘤的疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors， RECIST）和 mRECIST（modified RECIST）在免疫治疗中并不适用。以上问题的解决将有利于促进这种方法在HCC中的应用，全面实现其疗效。

4 小 结

免疫治疗很有可能作为一种革命性的治疗手段而载入肿瘤治疗历程。以检查点抑制、DCs疫苗和CAR-T细胞疗法为代表的免疫疗法已被应用于数千名侵袭性晚期肺癌、皮肤癌以及各种白血病和淋巴肿瘤患者中，其中不乏患者被“彻底治愈”。美国食品及药品管理局有望在不久的将来，批准CAR-T细胞疗法在临床中广泛使用。免疫疗法在肝癌中的应用更是处于初级阶段，我们还有更长的路要走，更加合理地选择免疫治疗，将会给患者带来更多的希望和机会。

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（2016-06-06 收稿 2016-07-05 修回）

（责任编委 李 军 本文编辑 卢福昱）

Current status and challenges of immunotherapy in hepatocellular carcinoma

QU Jian-hui， ZHANG Cui-hong， LI Ruo-ran， LU Yin-ying*Center of Therapeutic Research for Liver Cancer， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China *Corresponding author， E-mail: luyinying1973@163.com

Tumor immunotherapy is a promising， novel treatment strategy that may lead to improvements in both treatmentassociated toxicity and outcome. The key point for tumor immunotherapy is to inhibit immune checkpoint，overcome tumor immune escape and reconstruct anti-tumor immune mechanism. For hepatocellular carcinoma （HCC）， immunotherapy is still in an early stage of development. Immunotherapy， alone or in combination with other therapy methods， might provide an effective control of tumor cell growth. However， the overall therapeutic efficacy is still limited. Here， this review summarized current status and challenges of immunotherapy in hepatocellular carcinoma by combination of its progress of research and application.

carcinoma， hepatocellular； immune system； immunotherapy

·论 著·

［中国图书资料分类号］ R735.7； R457.2 A

1007-8134（2016）04-0193-06

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.04.001

国家自然科学基金面上项目（81470865）；解放军第三〇二医院院长创新基金课题（KJGG2015003）；

100039 北京，解放军第三〇二医院肝脏肿瘤诊疗与研究中心（曲建慧、张翠红、李若然、陆荫英）

陆荫英，E-mail: luyinying1973@163.com