支原体肺炎患儿外周血IL-35水平变化及其与NK细胞数、中性粒细胞功能的相关分析

袁浩,周毅峰,尹军,谢良伊

(1湖南省人民医院,长沙410005;2湖南师范大学医学院)



支原体肺炎患儿外周血IL-35水平变化及其与NK细胞数、中性粒细胞功能的相关分析

袁浩1,周毅峰1,尹军2,谢良伊1

(1湖南省人民医院,长沙410005;2湖南师范大学医学院)

摘要：目的观察支原体肺炎(MPP)患儿血清IL-35水平变化，并探讨其与自然杀伤(NK)细胞数和中性粒细胞功能的相关性。 方法 选择MPP患儿64例(观察组),健康体检儿童16例(对照组)。分别采用ELISA法检测血清IL-35；流式细胞术检测NK细胞所占百分比；金黄色葡萄球菌吞噬试验检测中性粒细胞的吞噬功能，IL-35与NK细胞所占百分比和中性粒细胞功能之间的相关性分析采用Pearson相关分析法。 结果与对照组比较，观察组血清IL-35水平升高(P<0.05)，NK细胞所占百分比与中性粒细胞吞噬率降低(P均<0.05)；MPP患儿外周血中IL-35水平与NK细胞数所占百分比呈负相关(r=-0.401，P﹤0.05)，IL-35水平与中性粒细胞吞噬率、吞噬指数呈负相关(r分别为-0.373、-0.388，P均﹤0.05)。结论 MPP患儿血清IL-35水平升高，其与NK细胞数和中性粒细胞功能均呈负相关关系。

关键词：支原体肺炎；IL-35；自然杀伤细胞；中性粒细胞

目前支原体肺炎(MPP)发病机制尚不完全明确，但是大量研究认为，其与免疫反应密切相关。白细胞介素35(IL-35)是至今发现的唯一一种由调节性T(Treg)细胞产生，抑制效应性T细胞活性的细胞因子，它的发现对于炎症反应、自身免疫病、Ⅰ型糖尿病等的免疫治疗有重要意义[1,2]。研究证实，IL-35主要是由Treg细胞分泌，是Treg细胞发挥免疫负调控的主要细胞因子[3，4]。国内外最新研究显示，IL-35 能抑制效应性T淋巴细胞、Th17 和CD8+T细胞的增殖，但与其他非T 细胞(NK 细胞、中性粒细胞、树突状细胞、Mφ等)的关系仍然未知。国内外多项研究证实，非T细胞在MPP患儿疾病发生发展过程中发挥了与T细胞同样重要的作用。本研究观察了小儿MPP患者外周血IL-35的水平变化，并探讨了其与NK 细胞及中性粒细胞功能的相关性。现报告如下。

1.1临床资料选择2015年1～5月本院收治MPP患儿64例(观察组)，均符合MPP诊断标准[5]。男36例、女28例，年龄6个月～7岁，按MP-IgM抗体滴度分为1∶80、1∶160、1∶320、1∶640四个亚组。临床表现为发热、咳嗽等症状，肺部有中小湿啰音，胸片可见一侧肺中或下野斑片状模糊影，MP-IgM抗体阳性。选择16例本院健康体检儿童为对照组，其中男8例、女8例，年龄1～6岁。两组性别及年龄具有可比性。

1.2标本的采集与处理于清晨空腹抽静脉血6 mL。其中2 mL促凝血3 500 r/min离心10 min后分离出血清，置于-70 ℃保存待检用于IL-35检测；2 mL EDTA-K抗凝血用于NK细胞检测；2 mL肝素抗凝血用于中性粒细胞吞噬功能检测试验。抗凝血均于当天采集后立即检测。

1.3血清IL-35检测采用ELISA法。每孔各加入标准品或待测样品100 μL，将反应板充分混匀后置37 ℃ 40 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，在滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL(空白除外)。将反应板充分混匀后置37 ℃反应20 min。再次洗板，每孔加酶标抗体工作液100 μL，将反应板置37 ℃ 10 min。第3次洗板，每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min。每孔加入100 μL终止液混匀，30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光值。所有A值减除空白值后再行计算，以标准品为横坐标，A值为纵坐标，作图，画出标准曲线。根据样品A值计算出相应IL-35水平。

1.4外周血中性粒细胞吞噬功能测定将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923置水浴中加热100 ℃ 10 min杀死细菌，用无菌生理盐水稀释成6×108/mL备用；吸取60 μL肝素钠抗凝血置于洁净凹玻片的凹孔内，加上述葡萄球菌菌液20 μL，充分混匀。然后置入铺有湿纱布的有盖容器内(此容器先放37 ℃温箱中预温)，在37 ℃温箱中作用30 min，其间每隔10分钟摇匀一次；作用完毕，取1小滴混合液置于洁净无油污的载玻片一端，推成薄片。待干后，滴加瑞氏A染液作用1~2 min，再滴加瑞氏B染液(洗耳球吹匀)作用2~3 min，水洗印干，置油镜下观察。随机计数100个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的白细胞数，对有吞噬作用的白细胞，同时记录所吞噬的细菌数。结果分析：吞噬率即100个中性粒细胞中吞噬有细菌的细胞数；吞噬指数为将100个中性粒细胞所吞噬的细菌总数除以100，得到每个白细胞吞噬细菌的平均数，即为吞噬指数。

1.5外周血NK细胞所占百分比测算采用流式细胞术。选用以下组合抗体，CD3-FITC/ CD( 16+56)-PE同时染色，圈定CD3-CD16+CD56+细胞即NK 细胞；流式管中加入50 μL MPP患儿EDTA抗凝血和CD3、CD16、CD56抗体各2 μL，混匀，室温避光孵育20 min，然后加入1 mL溶血素反应10 min，3 000 r/min离心10 min，去上清，加PBS溶液300 μL，用流式细胞仪测定。

2结果

2.1各组外周血IL-35水平、NK细胞所占百分比、中性粒细胞吞噬率及吞噬指数比较见表1。

表1　各组外周血IL-35水平、NK细胞所占百分比、中性粒细胞吞噬率及吞噬指数比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05;与1:160组比较，#P<0.05。2.2相关性分析MPP患儿中血清IL-35水平与外周血NK细胞所占百分比呈负相关(r=-0.401，P﹤0.05)，与中性粒细胞吞噬率呈负相关(r=-0.373，P﹤0.05)，与中性粒细胞吞噬指数呈负相关(r=-0.388，P﹤0.05)。

3讨论

近年MPP发病年龄提前，发病率在婴幼儿中有逐年升高趋势，病情严重者可导致死亡[6~7]。目前MPP发病机制尚不完全明确，但是其发病机制与免疫功能相关已得到广泛认同，并且认为免疫反应是MPP致病的重要因素[8]。所以，MPP患儿的免疫功能状况及控制其发生发展过程成为研究热点。

IL-35属于IL-12家族，2007年被证实在免疫、炎症性疾病病情调控中扮演重要角色。新近研究显示，IL-35可能与呼吸系统疾病的发病及进展有关[9]。本研究结果显示，MPP患儿各组中血清IL-35水平均较对照组明显升高。说明在健康儿童机体内IL-35表达处于正常水平，而当MP侵入患儿机体时，引起免疫系统紊乱，出现氧化应激和炎症反应，此时IL-35出现高表达，以防止损伤程度加重。

中性粒细胞是机体最重要的炎症细胞，是防御外来病原体的第一道防线。当外来病原菌进入机体时，炎症因子诱导中性粒细胞趋化和局部浸润，通过吞噬、呼吸爆发和脱颗粒杀灭病原体，从而发挥天然免疫清除病原体的效应。中性粒细胞表面表达IgG Fc受体和补体C3b受体，也可通过调理作用促进和增强中性粒细胞的吞噬、杀菌作用。本研究结果显示，MPP患儿中性粒细胞吞噬率较对照组下降，说明MP感染机体后，机体出现免疫功能紊乱，表现为患儿免疫功能低下，易于细菌感染。其机制可能与以下原因有关：①MP感染减少中性粒细胞表面FcrRI的表达，改变了中性粒细胞对胞外病原体的吞噬调理作用[10]，降低其吞噬功能；②MPP患儿细胞免疫功能紊乱，IgA水平升高[11]和C3水平降低[12]，IgA水平升高抑制了中性粒细胞吞噬作用或与抗原形成抗原抗体复合物，而后者封闭了中性粒细胞Fc和C3受体，致使被调理的微生物不易被中性粒细胞吞噬。C3b由C3裂解而来，C3降低必然导致C3b减少，使得金黄色葡萄球菌得不到调理，就不易被中性粒细胞吞噬[13]。

NK细胞是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞通过自然杀伤和 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，发挥重要的免疫调节功能，对获得性免疫的启动至关重要。本研究结果显示观察组NK细胞所占百分比明显低于对照组，说明MP感染患儿后，机体的非特异性免疫受到严重抑制，其可能机制为MP感染后抑制了NK细胞表面的受体,阻断了介导信号的传导,使NK细胞活性被抑制[14]。

本研究还显示， MPP患儿血清IL-35水平与 NK细胞数和中性粒细胞功能均呈负相关性。提示IL-35可能通过抑制NK细胞增殖和中性粒细胞功能而抑制过强的免疫反应，保护机体免受过度免疫反应伤害。

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(收稿日期：2015-10-08)

中图分类号：R563.1

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)01-0057-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.021

基金项目：湖南省教育厅科研项目(14C0701)；长沙市科技局科研项目(K1403060-31)；湖南省人民医院仁术重点课题(2013)。