Hg2+胁迫对花翅摇蚊（Chironomus kilensis）幼虫组织三种酶活性影响

刘曼红，张译文，汤　颖，潘　莹，常雄凯，陈　菲（东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨　150040）



Hg2+胁迫对花翅摇蚊（Chironomus kilensis）幼虫组织三种酶活性影响

刘曼红，张译文，汤颖，潘莹，常雄凯，陈菲
（东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨150040）

摘要：利用花翅摇蚊（Chironomus kilensis）开展长期低Hg2+浓度暴露下花翅摇蚊毒理效应研究，根据改良寇氏法设定质量浓度为0、0.003、0.009、0.027、0.081、0.243和0.729 mg·L-1氯化汞溶液，将花翅摇蚊卵带分别置于其中培养至子一代达4龄。紫外分光光度法测定摇蚊幼虫组织超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰胆碱酯酶（AChE）和过氧化氢酶（CAT）活性。通过LSD法多重比较检验不同浓度Hg2+暴露对三种酶活性影响。结果表明，仅0.003 mg·L-1处理组与对照组无显著差异（P>0.05），其他处理组SOD活性均升高，差异显著（P<0.05）；仅0.729 mg·L-1处理组与对照组AChE活性升高，差异显著（P<0.05）；各组CAT活性均无显著差异（P>0.05）。继续培养至子二代幼虫达4龄，测定CAT活性，各组无显著差异（P>0.05）。结果表明，花翅摇蚊幼虫在长期低Hg2+浓度暴露下，SOD和AChE活性对Hg2+具有较高敏感性，可作生物化学标志物监测水体Hg2+早期污染；CAT活性对Hg2+敏感度较低，因此CAT无法有效监测水环境早期Hg2+污染，但子二代比子一代酶活性整体升高，表明对汞适应性增强。

关键词：花翅摇蚊；汞；抗氧化酶；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；乙酰胆碱酯酶

刘曼红,张译文,汤颖,等. Hg2+胁迫对花翅摇蚊（Chironomus Kilensis）幼虫组织三种酶活性影响[J].东北农业大学学报, 2016, 47(2): 61-66.

Liu Manhong, Zhang Yiwen, Tang Ying, et al. Effect of Hg(II) exposure on activities of three enzymes in the larva of Chironomus kilensis[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(2): 61-66. (in Chinese with English abstract)

近年来，随污水排入水体中重金属越多，湖泊及河流重金属污染日益严重，受污染水体影响水生生物生存[1]。底栖动物活动范围相对固定，对水体污染敏感，常作为监测水质的指示生物。摇蚊幼虫是昆虫纲双翅目蚊科幼虫总称，分布广、种类多，生物量约占底栖动物总量70%~80%，构成水生食物网主要环节[2]。郑先云和葛士林研究发现，摇蚊幼虫解毒能力低、对污染物暴露敏感，生活周期短，实验室内易饲养，在水生态毒理学研究中应用广泛[3-4]。Vermeulen等针对摇蚊幼虫对水体中重金属敏感性，开展Hg2+对摇蚊幼虫慢性毒性试验[5]。Florence等发现抗氧化酶系统是生物体对抗由体内代谢或外源性污染物产生氧化应激有效的保护机制[6]，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等，常作指示环境污染的早期预警，成为分子毒理学生物标志物研究热点之一[7-9]。摇蚊幼虫作为水生态系统食物链关键环节，其体内抗氧化酶活性或表达量与重金属Hg2+浓度的效应关系，可作为监测环境污染指标。乙酰胆碱酯酶（AChE）是生物神经系统中的神经递质酶，可通过测定其活性探究对生物神经系统的影响。汞是水环境中极具毒性的重金属，以各种状态存在于水体、土壤及大气等环境中，逐渐产生迁移和积累，毒性涉及氧化应激，Hg2+可诱导自由基形成并改变细胞抗氧化能力[10-12]。

目前，摇蚊幼虫重金属毒性试验主要集中在急性和短期慢性毒性试验，通过长期慢性毒性试验探究重金属对摇蚊幼虫体内酶变化鲜见研究。李浩通过急性和短期慢性毒性试验研究铜与镉对羽摇蚊幼虫（Chironomus plumosus）和红裸须摇蚊幼虫（Propsilocerus akamusi）抗氧化酶活性及口器致畸影响[13]。赵燕等通过急性毒性试验研究杀菌剂戊唑醇对花翅摇蚊幼虫毒性及抗氧化酶系统的影响[14]。闫宾萍通过急性及短期慢性毒性试验研究汞和五氯酚对羽摇蚊幼虫半致死浓度、浓缩系数和致畸作用等[15]。长时间低Hg2+浓度胁迫下，生物体内抗氧化酶，如氧化物歧化酶和过氧化氢酶，对神经系统内乙酰胆碱酯酶活性产生的变化，尚待验证。本研究通过慢性Hg2+暴露毒性试验探究子一代摇蚊幼虫体内SOD、AChE和CAT生物指标变化规律，及子二代与子一代体内CAT比较分析，探究Hg2+对花翅摇蚊幼虫抗氧化系统及神经系统影响，评估花翅摇摇蚊幼虫对Hg2+胁迫敏感性。由于低重金属剂量作用下的长期慢性毒性试验与实际污染水体更接近，可为花翅摇蚊幼虫重金属污染生物监测提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

试验用花翅摇蚊为东北林业大学野生动物资源学院水生生物学实验室培养，已养殖10代以上，世代繁衍稳定，选择外形完整摇蚊卵带及子一代4龄幼虫试验。根据GB/T 27859-2011[16]配制试验用水和沉积物，置于5 L玻璃缸中，作为毒理试验培养装置。Hg2+为分析纯HgCl2（含量99.5%，姜堰市环球试剂厂）配置；试验时用蒸馏水将HgCl2配成一定浓度母液，再以蒸馏水稀释成所需浓度的试验溶液。通过相应试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定蛋白质、CAT、AChE和SOD。

1.2试验设计

1.2.1急性毒性试验

通过预试验确定花翅摇蚊幼虫24 h半数效应浓度（EC50）和急性试验Hg2+浓度梯度。各处理组培养皿中分别添加体积为300 mL，Hg2+浓度分别为1.024、1.280、1.600、2.000和2.500 mg·L-1HgCl2溶液，以配制试验用水作空白对照组。每一处理组设3个平行样，每一培养皿置虫体30条。随时观察摇蚊幼虫的中毒症状并及时挑出死亡个体，于24 h统计死亡数，死亡标准以探针触动摇蚊尾部，机械刺激无反应视为死亡。根据改良寇氏法得到花翅摇蚊幼虫24 h半数效应浓度为2.65 mg·L-1，95%置信区间（2.32，3.03）。

1.2.2慢性毒性试验

利用净水染毒法进行慢性毒性试验。以急性毒性试验得到的24 h-EC50（2.65 mg·L-1）的1/1 000为预计无作用剂量组，再以组间剂量差3倍设置试验浓度梯度，已通过预试验确认所设浓度皆在安全浓度范围内。设置Hg2+浓度分别为0（对照组）、0.003、0.009、0.027、0.081、0.243、0.729 mg·L-17个处理组，每组设置3个平行样。选出的花翅摇蚊虫卵带放入不同处理组Hg2+玻璃缸中，每缸放置5条卵带，容器用纱网罩住防止成虫逃逸，粒状金鱼幼鱼饲料喂幼虫，通过气泵向水中缓慢充氧，保证水中溶解氧满足摇蚊生长需求。培养期间水温保持26~28℃。培养至子一代摇蚊老熟幼虫时取部分虫体颜色鲜红、健壮、反应灵敏、大小一致4龄幼虫测定SOD、AChE及CAT活性。相同条件继续培养余下子一代花翅摇蚊，至子二代幼虫达4龄，同样条件下选择4龄幼虫，供后续子二代CAT活性测定。

1.2.3酶活性测定

将摇蚊幼虫虫体与生理盐水按质量体积比1∶9于冰水浴下组织匀浆，SOD、CAT和AChE以及蛋白质的测定，按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书以紫外分光光度法测定。

1.2.4数据处理

采用SPSS19.0统计软件对试验数据进行分析，数据用平均值±标准偏差（Mean±SD）表示。不同浓度下Hg2+对酶活性影响用SPSS软件单因素方差分析（One-way ANOVA）多重比较，子一代与子二代组间酶活性比较用独立样本t检验（t-test for Equality of Means）分析。

2结果与分析

2.1 Hg2+对花翅摇蚊子一代幼虫SOD活性影响

由图1可知，随Hg2+浓度增加，SOD活性呈递增趋势，设置最低浓度处理组（0.003 mg·L-1）SOD活性为（1.570±1.138）U·mg-1prot，最高浓度处理组（0.729 mg·L-1）达最大值（9.040±1.170）U·mg-1prot。通过LSD法多重比较，除设置的最低浓度处理组（0.003 mg·L-1）外，其他处理组SOD活性皆与对照组（0.000 mg·L-1）显著差异（P<0.05）。花翅摇蚊幼虫SOD活性呈现随溶液中Hg2+浓度增加而递增，显示其对汞一定敏感性，为适应在汞胁迫环境，不断增加SOD活性以减小对机体正常生理机能的损害，表现对汞的逐步适应性。

图1 Hg2+对花翅摇蚊幼虫SOD活性影响Fig. 1 Effects of Hg2+on the SOD activity in the larva of Chironomus kilensis

2.2 Hg2+对花翅摇蚊子一代幼虫AChE活性影响

由图2可知，随Hg2+浓度增加，花翅摇蚊幼虫组织匀浆中AChE活性呈先增后降再增趋势，Hg2+浓度为0.009 mg·L-1处理组AChE活性最低，为（10.070±0.030）U·mg-1prot，最高浓度处理组（0.729 mg·L-1）达最大值（0.171±0.074）U·mg-1prot。通过LSD法多重比较，Hg2 +浓度为0.729 mg·L-1处理组与对照组（0.000 mg·L-1）及Hg2+浓度为0.009、0.027、0.081、0.243 mg·L-1处理组间存在显著差异（P<0.05），而与Hg2+浓度为0.003 mg·L-1处理组无显著差异（P>0.05）。其他处理组（0.003、0.009、0.027、0.081、0.243 mg·L-1）皆与对照组无显著差异（P>0.05）。因此当水体中Hg2+浓度≤0.243 mg·L-1时，花翅摇蚊幼虫体内AChE对Hg2+不敏感，当Hg2+浓度达0.729 mg·L-1时，显示AChE对Hg2+敏感。AChE活性随Hg2+浓度升高呈先增后降再增趋势，原因是Hg2+浓度增加到一定水平前，对花翅摇蚊机体正常生理活动影响较小，变化不显著，而Hg2+达一定浓度后，花翅摇蚊幼虫为减弱汞胁迫对神经系统损害，AChE活性显著增加。

2.3 Hg2+对花翅摇蚊子一代幼虫CAT活性影响

由图3可知，Hg2+浓度对CAT活性影响为：当Hg2+浓度在0~0.027 mg·L-1时对CAT活性表现为促进作用，0.027~0.729 mg·L-1时表现为阻碍作用。当Hg2+浓度在0~0.003 mg·L-1时花翅摇蚊子一代4龄幼虫组织CAT活性变化较小；0.003~0.027 mg·L-1时，CAT活性值由1.854 U·mg-1prot到4.166 U·mg-1prot逐渐上升，Hg2+浓度在0.027 mg·L-1时，CAT活性达到最达值（3.862±1.537）U·mg-1prot，Hg2+浓度大于0.027 mg·L-1时，CAT活性值则缓慢下降，整个过程中CAT活性在（1.813±0.872）和（3.862±1.537）U·mg-1prot，呈先升后降趋势。与郑先云等研究结果[3]一致。子一代CAT活性组内变化差异不显著（P>0.05）。

图2 Hg2+对花翅摇蚊幼虫AChE活性影响Fig. 2 Effects of Hg2+on the AChE activity in the larva of Chironomus kilensis

图3 Hg2+对花翅摇蚊子一代幼虫CAT活性的影响Fig. 3 Effects of Hg2+on the CAT activity in the first filial generation larva of Chironomus kilensis

2.4 Hg2+对花翅摇蚊子二代幼虫CAT活性影响

由图4可知，花翅摇蚊子二代4龄幼虫CAT活性水平明显高于子一代，整体水平在（5.562± 1.300）~（7.188±2.161）U·mg-1prot。表现先升后降趋势，与本研究子一代结果相同。子二代花翅摇蚊4龄幼虫不同Hg2+浓度组间CAT活性变化幅度小于子一代。在Hg2+浓度为0.081 mg·L-1处理组CAT活性达到最大值（7.188±2.161）U·mg-1prot。该峰值出现时，汞溶液浓度高于子一代出现CAT活性最大值时汞溶液浓度。原因是花翅摇蚊长期受汞胁迫，子二代幼虫较子一代对含有重金属汞的生活环境适应性增强，为减少汞对机体损害而提高体内CAT活性，增加对Hg2+耐受性。各处理组与对照组间差异不显著（P>0.05）。

图4 Hg2+对花翅摇蚊子二代幼虫CAT活性影响Fig. 4 Effects of Hg2+on the CAT activity in the second filial generation larva of Chironomus kilensis

2.5 Hg2+胁迫对不同子代CAT活性影响比较与分析

比较子一代与子二代花翅摇蚊幼虫组织CAT活性变化，子一代4龄幼虫组织CAT活性在汞胁迫下变化明显，而子二代变化不大；另一方面，子二代花翅摇蚊4龄幼虫CAT活性普遍高于子一代，说明子二代幼虫产生的活性氧增高，子二代4龄幼虫体内CAT处理H2O2能力高于第一代，不易受重金属Hg2+浓度影响，耐受性突出。

比较花翅摇蚊子一代与子二代幼虫相同浓度处理组间CAT活性。如图5所示，0.000、0.003、 0.081、0.243 mg·L-1处理组间CAT活性显著差异，0.009与0.027 mg·L-1处理组间无显著差异。

比较两代花翅摇蚊幼虫组织CAT活性Hg2+胁迫下差异，可见低浓度Hg2+作用下，花翅摇蚊幼虫体内过氧化氢酶（CAT）处于激活状态，摇蚊幼虫清除体内H2O2能力增强，反映花翅摇蚊对轻度重金属浓度胁迫适应性，而高浓度下CAT活性降低，体内H2O2清除能力下降，导致活性氧在摇蚊幼虫体内产生与消除的动态平衡被打破，花翅摇蚊机体受到伤害。这种低剂量下表现适当兴奋效应以及高浓度下表现抑制效应，符合毒物兴奋效应[17-19]。

图5花翅摇蚊子一代与子二代幼虫CAT活性比较Fig. 5 Comparation of CAT activity between the first and second filial generation larva of Chironomus kilensis

3讨论

SOD和CAT等抗氧化酶易受外界刺激影响，生物机体抗氧化状态测定，对理解毒性效应机制及预测生物体内潜在性损伤具有重要作用[20]，抗氧化防御系统作为环境污染胁迫指标，活性成分或含量受污染物胁迫发生改变，可间接反映环境中氧化污染。低水平汞暴露时，神经元是汞的主要靶细胞[21]，作为神经递质酶的AChE在汞暴露试验中具有重要作用。本试验对花翅摇蚊暴露于低HgCl2浓度中培养慢性毒性研究表明，子一代幼虫体内SOD活性表现Hg2+胁迫下诱导效应，SOD活性随汞浓度升高而增加；AChE活性随Hg2+浓度升高而呈现先增后降再增趋势，Hg2+浓度增加到一定水平前，变化并不显著，到达一定浓度后，花翅摇蚊幼虫为减弱汞胁迫对神经系统损害，AChE活性明显增加。CAT活性和含量虽具有随Hg2+浓度升高而增加趋势，但整体无显著差异。

为探究汞胁迫下花翅摇蚊幼虫CAT活性变化，本试验在相同条件下继续培养花翅摇蚊，至子二代幼虫达到4龄，再次测定CAT活性[22]。子二代幼虫CAT活性整体变化趋势与子一代相似，呈先升后降趋势，酶活性随汞浓度变化差异不显著。但活性整体高于子一代，CAT活性最大时汞溶液浓度高于子一代CAT活性最大时汞溶液浓度。原因是花翅摇蚊几个世代在汞胁迫条件下生存繁衍，为更好适应生存环境，减少汞对机体损害，逐渐提高体内CAT活性，Hg2+耐受性增加。花翅摇蚊2个世代4龄幼虫在相同条件下CAT活性差异，表明子二代幼虫较子一代对汞生活环境产生适应性。

后续试验应设置更高汞浓度处理组，研究花翅摇蚊幼虫上述酶长期在低浓度汞胁迫下完整变化趋势，探讨谷胱甘肽过氧化物酶等其他抗氧化酶活性变化，SOD、AChE等世代间酶活性变化及畸变程度。

4结论

本试验结果表明，花翅摇蚊幼虫组织SOD、AChE及CAT三种酶长期在低浓度汞胁迫下具有不同敏感性。花翅摇蚊子一代幼虫组织SOD对Hg2+具有较高敏感性，含量和活性均呈明显剂量-效应关系，可作为生物标志物监测水体中Hg2+早期污染；AChE活性在Hg2+到达一定浓度后，可作为水体早期污染生物指标；花翅摇蚊子一代和子二代幼虫组织CAT对Hg2+溶液浓度变化无较高敏感性，不适合监测水体Hg2+早期污染。但子二代CAT活性整体高于子一代CAT，表现为花翅摇蚊对含汞环境适应。

[参考文献]

[ 1 ] McCarthy J F, Shugart L R. Biomarkers of environmental contamination[M]. Baca Raton: Lewi, Publishers, 1990.

[ 2 ]张彤,金洪钧.摇蚊幼虫的水生态毒理学研究进展[J].环境保护科学, 1995, 21(4): 17-17.

[ 3 ]郑先云,龙文敏,郭亚平,等. Cd2+对红裸须摇蚊的急性毒性研究[J].农业环境科学学报, 2008, 21(1): 86-91.

[ 4 ]葛士林,曹传旺,王志英.三种农药对红裸须摇蚊体内蛋白质质量分数和AChE活性的影响[J].东北林业大学学报, 2011, 39(1): 108-109, 126.

[ 5 ] Vermeulen A C, Liberloo G, Dumont P, et al. Exposure of Chironomus riparius larvae (diptera) to lead, mercury and β-sitosterol: Effects on mouthpart deformation and moulting[J]. Chemosphere, 2000, 41: 1581-1591.

[ 6 ] Florence G, Angela S, Maria joão B. Antioxidant enzyme activities, metallothioneins and lipid peroxidation as biomarkers in ruditapes decussatus[J]. Ecotoxicology, 2003(12): 417-426.

[ 7 ] Pascual P, Pedrajas J R, Toribio F, et al. Effect of food deprivation on oxidative stress biomarker in fish (Sparus aurata)[J]. Chemico-Biological Interaction, 2003, 145: 191-199.

[ 8 ] Oruc E O, Sevgiler Y, Uner N. Tissue-specific Oxidative stress responses in fish exposed to 2, 4-D and azinphosmethyl[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, 2004, 137(1): 43-51.

[ 9 ] Zhang S, Ferrarini A, Giacomelli E, et al. Effects of chronic exposure of 2, 4-dichlorophenol on the antioxidant system in liver of fresh water fish Carassius auratus[J]. Chemosphere, 2004, 55(2): 167-174.

[10] Lund B O, Miller D M, Woods J S．Studies on Hg(II)-induced H2O2formation and oxidative stress in vivo and in vitro in rat kidney mitochondria[J]. Biochemical Pharmacology, 1993, 45(10): 2017-2024.

[11] Hussain S, Rodgers D A, Duhart H M, et al. Mercuric chloride-induced reactive oxygen species and its effect on antioxidant enzymes in different regions of rat brain[J]. Journal of Environmental Science and Health, 1997, 32(3): 395-409.

[12] Kobal A B, Prezelja M, Horvatb M, et a1. Glutathione level after long-term occupational elemental mercury exposure[J]. Environmental Research, 2008, 107(1): 115-123.

[13]李浩.铜和镉对羽摇蚊幼虫（Chironomus himosus）和红裸须摇蚊幼虫（Propsilocerus akamusi）的毒性效应[D].武汉:华中农业大学, 2012.

[14]赵燕,汤保华蔡,磊明,等.杀菌剂戊唑醇对花翅摇蚊幼虫的急性毒性和抗氧化酶系统的影响[J].农药, 2012, 51(6): 445-460.

[15]闫宾萍.镍、汞和五氯酚对摇蚊幼虫的毒性作用[D].青岛:青岛科技大学, 2006.

[16]中国国家标准化管理委员会, GB/T 27859-2011,化学品沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法[S].北京:中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 2011.

[17]袁雪峰.低剂量氯化镉诱导L929细胞增殖hormesis效应的研究[D].广州:暨南大学, 2013.

[18] Calabrese E J, Blain R. The occurrence of hormetic dose responses in the toxicological literature, the hormesis database: An overview[J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2005, 202 (3): 289-301.

[19]段维霞,江高峰.毒物兴奋效应及其潜在应用价值研究进展[J].中国公共卫生, 2012, 28(6): 859-860.

[20] Hussain S, Rodgers D A, Duhart H M, et a1. Mercuric chloride-induced reactive oxygen species and its effect on antioxidant enzymes in different regions of rat brain[J]. Journal of Environmental Science and Health, 1997, 32(3): 395-409.

[21] Schiomming J D, Danscher G. Autometallographic mercury correlates with degenerative changes in dorsal root ganglia of rats intoxicated with organic mercury[J]. APMIS, 1999, 107(3): 303-310.

[22]黄斌,张达,李洋,等.铬污染对李氏禾生理指标的影响[J].东北农业大学学报, 2012, 43(1): 121-126.

Effect of Hg(II) exposure on activities of three enzymes in the larva of Chironomus kilensis

LIU Manhong, ZHANG Yiwen, TANG Ying, PAN Ying, CHANG Xiongkai, CHEN Fei(School of Wildlife Resources, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Abstract:The paper was conducted to evaluate the toxicity effect of Hg2+on aquatic insects. Put the eggs of Chironomus kilensis larvas into the Hg2+solution with the concentration of 0, 0.003, 0.009, 0.027, 0.081, 0.243 and 0.729 mg·L-1until they developed to fourth larval of the first filial generation. Then the activities effect of CAT, AChE and SOD were studied on homogenate of Chironomus kilensis larvas by ultraviolet spectrophotometry. The experiment used the test of least significant difference (LSD) multiple comparisons to compared different Hg2 +concentration's influence on three enzyme activities. Results showed that no significant difference of SOD was on 0.003 mg·L-1treatment group with the control group (P>0.05). The enzyme activity of other treatment groups were increased. Only thebook=62,ebook=67AChE of the 0.729 mg·L-1treatment group increased and had a significant difference with the control group (P<0.05). And all the groups had no significant difference on CAT. Assay of CAT activity again when the second filial generation developed to fourth larval. And all the groups had no significant difference. The research showed, exposed in a long-term low concentration of Hg2 +, both SOD and AChE of the Chironomus kilensis larva had a high sensitivity. And they can serve as a biochemical marker in monitoring pollution of Hg2 +early. The CAT had a low sensitivity, thus it wasn't an effective target to test the early water pollution about Hg2+. While the CAT activity of the second filial generation had an allover increase than that of the first filial generations. And the second filial generation showed a higher adaptability.

Key words:Chironomus kilensis; mercury; antioxidase enzymes; SOD; CAT; AChE

作者简介：刘曼红（1973-），女，副教授，博士，研究方向为水环境毒理学。E-mail: liumh213@aliyun. com

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助（2572014EA07-03）；东北林业大学国家级实验教学示范中心建设专项（201307）

收稿日期：2015-09-28

中图分类号：X835

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）02-0061-06