烟草青枯病的生物防治研究进展

冯 吉， 黎妍妍， 程 玲， 余 君， 蔡长春

(湖北省烟草科学研究院，湖北武汉 430030)



烟草青枯病的生物防治研究进展

冯 吉， 黎妍妍， 程 玲， 余 君， 蔡长春*

(湖北省烟草科学研究院，湖北武汉 430030)

烟草青枯病又称烟瘟，是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的以土壤传播为主的细菌性病害。该病害是一种典型的维管束病害，在一般条件下从植株根部伤口侵入并进入维管束，同时分泌果胶酶、纤维素毒等分解中胶层，使皮层和髓部组织腐烂，最显著的症状是枯萎，一旦发病即可造成烟草全株死亡，是烟草生产中一大毁灭性病害，广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖地区[1]。该病害是我国南方烟草种植区常见的重要病害之一，其中以贵州、湖南、广东、四川等烟区发病尤为严重，常给烟叶生产造成毁灭性损失[2-3]。

烟草青枯病的防治历来受国内外烟草研究人员的高度重视，是当今烟草病理学研究的最热门课题之一。早期国内外研究人员在抗病品种选育、化学防治、农业防治等方面进行了大量研究，但防治效果均不理想。例如，在抗病品种选育方面，烟株的抗性随着病菌致病力的变化容易丧失并易受其他多种因素的影响，导致抗病品种选育难以成功[4-5]；化学防治方面，化学药剂的后期防效差且病菌易产生抗药性，使得化学药剂防治青枯病的效果并不显著[6]；农业防治虽然能够降低青枯病的发病率，减轻其对烟叶生产的危害，但受地域条件限制而难以大面积推广。因此，探讨和寻找新的防治方法以控制烟草青枯病的发生和蔓延十分必要[7]。生物防治具有安全无公害、长效等优点，是烟草青枯病害防治中最前沿的研究方向，目前已进行的生物防治研究主要集中在无致病力青枯菌菌株、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞杆菌、菌根真菌、噬菌体以及转基因植物的研究与应用等方面。笔者综述了近些年国内外研究人员在烟草青枯病生物防治方面的研究进展，以期为烟草青枯病的生物防治提供参考。

1无致病力青枯菌菌株的研究与应用

1954年Okabe[8]首次发现青枯菌株之间存在拮抗作用后，国内外许多学者开展了利用无致病力青枯菌防治烟草青枯病的研究与应用工作。Chen等[9-11]用无致病力青枯菌菌株防治烟草青枯病，均取得温室或小区试验的良好防效，但后期防效降低。郑继法等[12]研究烟草无致病力青枯菌菌株对烟草青枯雷尔氏菌4-11的防治作用，发现A3-5、A4-3、A1-4这3个无毒菌株对致病菌4-11均有防治效果，其中A3-5的防效最好，病情指数比对照降低80%，推迟25 d发病。肖田等[13]从茄子、番茄、辣椒、烟草青枯病株中分离出116株无致病力青枯菌，采用室内平板喷雾法对116株无致病力青枯菌菌株进行拮抗试验，结果表明有21株无致病力青枯菌菌株在NA培养基上可明显抑制青枯菌的生长；同时利用烟草MsK326品种温室盆栽控病试验表明，有2株无致病力青枯菌菌株具有较好防效，20 d后的相对防效分别为58.4%和97.0%。另外,福建省农业科学院利用无致病力青枯病菌研制出一种新型的“植物疫苗”，可有效防治相关植物青枯病的发生，主要用于防控茄子、番茄、辣椒、烟草等植物青枯病的发生[14]。肖田等[15]采用喷雾法及含菌培养基法测定青枯无致病力菌株对青枯致病菌的抑制作用，并进行烟草青枯病温室盆栽控病试验。结果表明，在温室盆栽试验中它对烟草青枯病具有较好的防效，接种致病菌30 d后相对防效达77.5%，并发现青枯无致病力菌株除可直接抑制青枯致病菌外，很可能诱导烟草产生青枯病抗性。上述研究表明，利用无致病力青枯菌防治烟草青枯病的研究在温室和小区试验中均可取得良好的防效效果，但大田试验未能取得成功，这可能是无致病力青枯菌菌株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏与其他微生物的竞争力所致。

2芽孢杆菌的研究与应用

芽孢杆菌(Bacillusspp.)是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，具有分离频率高、易培养、易保存、有效期长等特性，是生防菌研究中的重点。用于防治青枯病的芽孢杆菌主要有多黏类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyza)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、凝固芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)等。董春等[16]从烟草、番茄、芒果、柑橘等农作物根和根部土壤中分离并筛选到对青枯病菌具有较强抑菌作用的细菌5株，初步鉴定为芽孢杆菌，网室盆栽试验和发病地小区试验结果表明拮抗细菌对烟草青枯病具有一定的防治作用。孔凡玉等[17]在福建、广东、贵州等地感染青枯病烟株根部及番茄根部分离出微生物菌系36个，并以烟草青枯病病原菌为靶标，通过室内抑菌试验筛选出对青枯病具有拮抗作用的3个芽孢杆菌属，2个属于假单胞杆菌，防效在70%以上。陈巧玲等[18]运用荧光定量PCR 方法，研究了生物有机肥对盆栽烟草根际青枯病原菌和拮抗菌动态变化的影响，结果表明，添加有短芽孢杆菌的生物有机肥能够抑制土壤青枯菌的增长和促进植物生长。段燕平等[19]从云南和贵州烟草青枯病重病区采集600份健康烟草根基土壤，从中筛选出1株对烟草青枯病菌株具有较强拮抗的枯草芽孢杆菌，该菌株在室内平板抑菌试验中对烟草青枯病菌株防效达到66.0%，并初步确定枯草芽孢杆菌菌株产生的主要抑菌活性物质为蛋白多肽类物质。陆铮铮等[20]从贵州省天柱县、黄平县及大方县烟草根围土壤中筛选分离出20株烟草青枯病菌的拮抗细菌，平板喷雾法试验结果表明其抑制效果稳定，其中2株拮抗细菌分别为蜡样芽孢杆菌和球形赖氨酸芽孢杆菌。

3链霉菌的研究与应用

自然界中70%以上的抗生素是由链霉菌产生的，所以在生产实践中该类菌常直接用于烟草青枯病的生防。李大鹏等[21]为探索烟草青枯病的高效防治体系，研究了农用链霉素不同施用方法和施用频次对青枯病的防治效果。结果表明，药签插茎与灌蔸相结合方法的防治效果要明显好于单一使用，施药后60 d对青枯病的最高防治效果达49.02%。胡述泉[22]选用农用链霉素泡腾片，以烟田常用药剂农用链霉素可湿性粉剂为对照，进行了田间小区药效试验。结果表明，农用链霉素泡腾片与农用链霉素可湿性粉剂配合使用的情况下最高防效可达62.00%，平均防效为56.82%。左娟等[23]以青枯灵、农用链霉素、青萎散等为研究对象，探讨不同药剂对烟草青枯病的防治效果，其中大蒜和农用链霉素防效在65%～70%。蒋承耿等[24]采用室内抑菌试验和田间小区试验研究了几种杀菌剂对烟草青枯病病原菌的毒力和田间防效，发现40%硫酸链霉素SP室内抑菌效果最好，而在田间防治试验中72%农用链霉素SP的防效最差。

4假单胞杆菌的研究与应用

从土壤中分离到的革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌和链霉菌菌株，往往很少能够在植物的根区定殖并形成一个庞大的群体，而假单胞杆菌属(Pseudomonas)细菌常能在植物根围土壤中大量增殖，对植物有抑制病害、促进生长的作用。罗宽等[25]从番茄、烟草和木麻黄根周围土壤中分离出606个假单胞杆菌菌株，通过筛选发现拮抗菌菌株94a和22a对番茄、烟草青枯病有一定防治效果。胡军华等[26]从重庆烟区田间分离获得一株烟草根际细菌铜绿假单胞菌属的拮抗菌株swu31-2，通过灌根接种试验和盆栽试验研究其在烟草根、茎和叶表面及内部的定殖能力及其对烟草青枯病的防治作用。结果表明，wu31-2的菌液和活性物质对烟草青枯病均有一定的防治效果，并且优于农用链霉素。董夏伟等[27]从重庆烟区健康土壤中筛选出一株铜绿假单胞菌属的拮抗菌，通过平板对峙试验表明该菌株对烟草青枯菌有明显的抑制作用。舒翠华等[28]以烟草青枯病菌为指示菌，采用对峙培养法和抑菌活性试验，从感染青枯病的烟草品种K326侧根内分离到的大量内生菌中筛选出一株抑菌效果最好的内生拮抗细菌HN3，最终通过16S rDNA序列鉴定、BlologI微生物自动鉴定系统鉴定和系统发育学分析确定其属于假单胞杆菌。

5菌根真菌的研究与应用

菌根真菌由于一部分在根外，一部分在根内，使其能够紧密地与根系联系，以增加其对植物的作用，所以其重要作用受到研究者的广泛关注，并将其应用于烟草青枯病的生物防治。江龙等[29]通过盆栽试验和病区大田试验比较了菌根和非菌根烟苗移栽后的青枯病发病率、病情指数以及接种青枯菌后烤烟根系几丁质酶活性变化。结果表明，丛枝菌根(AM)真菌可能与烟草青枯菌争夺烤烟根系上的侵染位点，导致菌根烟苗能推迟青枯病的发病时间，降低发病率和病情指数，提高烤烟抗青枯病的能力。曾维爱等[30]采用漂浮育苗技术培育烟苗，于播种期分别接种摩西球囊霉、聚丛球囊霉和生防制剂进行烟苗农艺性状、烟叶化学成分及抗病性等比较试验，研究发现漂浮育苗时接种摩西球囊霉+生防制剂(20 mL)处理可更好地改善烟株综合素质。陆铮铮等[31]对从健康的烟草根际土壤中分离获得的烟草青枯菌土壤拮抗真菌进行了筛选和鉴定，结果表明，分离获得的56株真菌中有3株具有拮抗作用，拮抗效果从高到低依次为淡色生赤壳菌、棘孢木霉和嗜松青。刘先良等[32]采用盆栽试验研究了接种AM真菌对烟草青枯病发病情况的影响，发现Glomusintraradices和Glomusmosseae可促进烟草植株生长，同时降低烟草青枯病的病情指数及发病率，表明接种AM真菌能提高烟株对烟草青枯病的抗性。

6噬菌体的研究与应用

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因具有能够高效、持续的裂菌作用以及对机体和环境无毒性、无刺激作用，避免了环境污染、生态破坏及农药残留等问题，使其有望成为生物防治烟草青枯病的重要组成部分。Tanaka等[33]用含噬菌体的无毒青枯菌株M4S对烟草进行预处理，可有效降低青枯病的发病程度，发病率从95.8%下降到40%以下。高苗等[34]从烟草青枯病重病田健康烟株的根际土壤中分离到裂解性的青枯病菌噬菌体，经过测定各项生物学特性，发现其潜伏期较短、裂解能力较强，具有很好的杀菌效果，且裂解活性持续时间长，并能在不同温度、不同酸碱性的环境中有较强的适应能力，具有开发为抗青枯病菌菌剂的潜力。然而，噬菌体具有高度的特异性，往往只对某一型或几型的细菌有效，而对其他菌株裂解效果很弱或无治疗作用，使其应用范围受到很大的限制。

7转基因植物的研究与应用

目前，烟草抗细菌病害的基因工程研究尚处于抗病基因的分离阶段，并且研究仍限于对细菌素及其作用的分析和细菌素基因的分子生物学研究等方面。Jaynes 等[35]将可抑制烟草青枯病的抗菌肽cecropin B的类似物shival基因转入烟草植株，然后在其转基因阳性子代中进行青枯病接种试验，结果显示转基因烟草材料比对照推迟发病时间，降低了发病率和病情指数，提高了烟草抗青枯病的能力。傅荣昭等[36]通过转基因技术将含有防御素NP-1的表达载体导入烟草材料中，并通过筛选获得阳性转基因烟苗，最后通过抗菌试验表明转基因烟草抗青枯病的能力得到提高，显著延缓了烟草青枯病的发病时间。陈艳等[37]构建苋菜抗菌肽(Ah-AMP)基因的植物表达载体后通过根癌土壤杆菌介导方法转化了烟草材料，并筛选获得T0和T1代转基因烟草，最后采用烟草青枯病的抗病性试验发现转基因烟草能够推迟青枯病的发病时间，延缓发病速度。牛毅等[38]采用转基因方法获得转群体感应淬灭基因attM的烟草材料，通过离体及活体检测试验表明转attM基因的烟草植株对烟草青枯病的抗性达显著水平。上述研究结果表明，虽然植物抗病基因工程研究在安全性方面还有许多争议，但它仍是一个有潜力的防病方法，值得探索。

8问题与展望

尽管国内外对烟草青枯病生物防治的研究取得了进展，采用无致病力青枯菌菌株、芽孢杆菌、链霉菌等方法对烟草青枯病具有一定的防治作用，但试验范围主要局限于盆栽或小区试验，很少能够进入大田示范和推广。目前，在市面上比较常见的能够选择的以生防菌为有效成分登记的防治烟草青枯病的农药有青枯散、青枯停、酵素菌、克菌康等，尽管这些微生物活菌制剂对烟草青枯病的防治在实际生产应用中较为理想，但防治效果的不稳定因素也较多，主要体现在不同地区和不同作物的防效差异较大，前期防治效果较好而后期防治效果较差。因此，目前对烟草青枯病的生物防治应综合多种措施，充分利用生防菌、转基因植株和抗性诱导剂等生防因子的综合作用，加强拮抗菌复配施用的研究，探索新型的田间应用技术以有效控制青枯病的发生与流行，从而实现高效、简便、经济地防治植物青枯病，保证防治效果的持续和稳定。

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摘要概述了国内外应用无致病力青枯菌菌株、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞杆菌、菌根真菌、噬菌体、转基因植物对烟草青枯病进行生物防治的研究进展，指出了目前该方面研究中仍存在的问题并展望了应用前景。

关键词烟草；青枯病；生物防治

Research Advances in Biological Control of Tobacco Bacterial Wilt

FENG Ji，LI Yan-yan，CHENG Ling，CAI Chang-chun*et al (Tobacco Research Institute of Hubei Province，Wuhan，Hubei 430030)

AbstractThe latest research progresses in the biological control of tobacco bacterial wilt were summarized，including the application of avirulent strains ofRalstoniasolanacearum，Bacillusspp.，Streptomycesspp.，Pseudomonassp.mycorrhizal fungi，phage，transgenic plant，the existing problems in current research were proposed，and the application prospect was forecasted.

Key wordsTobacco; Bacterial wilt; Biological control

收稿日期2015-07-29

作者简介冯吉(1981- )，男，湖北武汉人，农艺师，博士，从事分子生物学与生物信息学研究。*通讯作者，博士，从事遗传学与分子生物学研究。

基金项目中国烟草总公司湖北省公司重点项目(027Y2012-098，027Y2013-002)；中国烟草总公司科技重点项目(110201502018)。

中图分类号S 435.72

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-203-03