激光扫描共聚焦显微镜在园艺植物研究中的应用

王 健，杨 青，孟庆杰

(聊城大学生命科学学院，山东聊城 252059)



激光扫描共聚焦显微镜在园艺植物研究中的应用

王 健，杨 青，孟庆杰*

(聊城大学生命科学学院，山东聊城 252059)

摘要综述了激光共聚焦显微镜的原理以及激光扫描共聚焦显微镜技术在园艺植物细胞学、植物荧光方面、发育生物学和遗传学的应用研究进展，并对其在园艺植物研究中的应用前景进行了展望。

关键词激光扫描共聚焦显微镜；园艺植物；荧光；花粉粒

Application of Laser Scanning Confocal Microscope in Horticultural Plants

WANG Jian, YANG Qing, MENG Qing-jie*(College of Life Science and Technology, Liaocheng University, Liaocheng, Shandong 252059)

AbstractThe principle of laser scanning confocal microscope and the research progress on application in horticultural plant pollen morphology, pollen cytoskeleton, cytology, genetics, developmental biology, and plant fluorescence were reviewed, the application prospect in researches of horticultural plants was forecasted.

Key wordsLaser scanning confocal microscope; Horticultural plants; Fluorescence; Pollen grains

激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是20世纪80年代中期发展起来的一种无损深层形态结构分析的新技术,在医学、材料学、生物科学、植物学等领域有着广泛应用。它是集显微技术、高速激光扫描、电子摄像及计算机图像处理技术为一体的现代高科技手段。该技术虽然已经深入生物学研究的各个领域，但在园艺植物方面的研究中应用较少。鉴于此，笔者综述了LSCM的原理以及激光扫描共聚焦显微镜技术在园艺植物细胞学、植物荧光方面、发育生物学和遗传学的应用研究进展，以期为该技术在园艺植物上的推广应用提供参考。

1LSCM的原理

LSCM是在不损害原有结构的基础上进行的一种深层形态结构分析的新技术。由于不同的样品对激光发射器的要求不同，常用的激光器有ArUV(351、364 nm)、AR(457、488、514 nm)、HeNe(543、633 nm)等。

LSCM的基本原理是运用紫外光或可见光的激光扫描束通过光源针孔形成的点光源，对自己能发出荧光的标本或经荧光染料标记后能发出荧光的标本的焦平面上进行逐点扫描，激发其产生荧光。采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管，经光电倍增管检测出发射光的波长及强度，然后经过计算机的转换，最终在显示屏上形成样品的二维和三维图像。由于入射光源针孔及检测针孔与物镜焦平面的位置是共轭的关系，所以进行点扫描时，焦平面上的点会同时聚焦于光源针孔和检测针孔上，以便抑制在同一焦点平面上非测点的散杂荧光以及来自样品中的非焦平面的荧光，从而达到只有扫描点成像而其他的干扰点不会成像的目的，最终经过逐点扫描形成整个标本的光学切片。目前，激光扫描共聚焦显微镜具有高反差、高灵敏度、高分辨率等优点，可对样品进行无损伤、逐层的扫描[1-4]。

2LSCM在园艺植物细胞学研究中的应用

2.1LSCM在花粉粒形态结构研究中的应用何川生等[5]利用LSCM技术对37种烟草花粉进行了观察，发现不同的烟草花粉的形态结构有差异，而同一品种烟草花粉形态结构较稳定，为烟草分类及其进化研究提供重要依据。李林光等[6]利用LSCM技术对四倍体品种天星苹果及二倍体富士苹果的花粉萌发力、花粉形态及胚囊发育特征进行观察研究，寻找到天星苹果在结果方面不及富士苹果的原因，以便更好地改进，培育出优良品种。李国平等[7]为了研究不能自发荧光的黑松花粉管，对其进行荧光标记，然后利用LSCM技术研究了其形态结构并观察了不同浓度的蔗糖对花粉管生长的影响，进而对比了其与被子植物的不同。丁亮等[8]应用LSCM技术对红花粉粒进行扫描，利用Laser-Sharp图像处理软件重建其三维结构，并叙述了LSCM的成像原理、特点以及在植物孢粉学研究中的应用前景。

2.2LSCM在花粉细胞骨架研究中的应用李国平等[9]用4种不同的染色剂和染色方法对雪松花粉和花粉管进行染色，在特定的激发光源下，通过试验发现经曙红-Hoechst 33342双染的雪松样品细胞核结构最清晰，建立了一种简便易行、有效的制片程序，并用LSCM技术较好地展现了雪松花粉和花粉管的细胞结构及其细胞核状态、行为。

李岩等[10]应用免疫荧光和荧光标记方法，结合LSCM技术，观察百合花粉以及花粉管内微丝和微管的分布，结果表明化学固定方法较好地保存花粉和花粉管内微丝；用免疫荧光法标记发现微管大多分布在距离花粉管顶部10～20 μm的范围内；在花粉管中，存在共分布现象的微丝骨架与微管骨架并不多，只有少数微丝与微管是相互平行排列的。

李国平等[11]利用LSCM技术和免疫荧光标记法对黑松的花粉和花粉管中微管的骨架进行研究，通过在含秋水仙碱的培养基中萌发的黑松与正常萌发的黑松花粉管的结构对比，发现了含秋水仙碱的培养基中萌发的黑松花粉管顶端肿胀产生的原因。研究表明，与被子植物相比，裸子植物花粉管顶端的微管网络对花粉管顶端的形态及生长方向非常重要。

徐霞等[12]以川百合花粉原生质体为材料，以微量DMSO为渗透剂、Alex-phalloidin为探针的荧光标记，并结合LSCM技术，研究了蛋白质酪氨酸磷酸化作用参与花粉原生质体在极性形成、花粉管萌发及花粉管生长过程中微丝骨架的列阵变化。

2.3LSCM在细胞内、外Ca2+变化及其作为信号转导因子的研究尚忠林等[13]以川百合花粉为材料，利用孵育法在花粉原生质体中，特别是利用低温装载法在完整花粉粒中成功地载入酯化形式的Ca2+荧光探针Fluo-3AM，并利用LSCM技术对花粉细胞质中游离Ca2+的分布特点进行研究。

鲁振华等[14]采用LSCM技术，以Fluo-3AM-ester为荧光探针研究桃果肉和叶柄组织中Ca2+的分布，结果表明Fluo-3AM-ester可作为荧光探针对桃不同组织中游离的Ca2+信号强度和分布特征进行分析，为进一步研究Ca2+对果实品质的影响、合理喷施钙元素提供了理论依据。

郭光明等[15]利用LSCM技术观察低温装载有Ca2+荧光探针Fluo-3的百合花粉细胞内游离Ca2+与培养基中硼酸的关系。结果表明，硼能促进细胞外的Ca2+进入细胞内，维持百合花粉细胞内游离Ca2+较高的浓度。

3LSCM在园艺植物荧光方面的应用

周建涛等[16]采用LSCM技术研究了外源钙调素(CaM)及其抗血清对“丰水”梨白花(不亲和)和异花(亲和)授粉后花柱自发荧光变化的影响。结果表明，外源CaM及其抗血清对白花、异花授粉的生理代谢过程均有影响，为研究钙调素在植物自交不亲和性反应中的作用提供了理论依据。

何川生等[17]利用LSCM技术对不同类型烟草材料的花粉自发荧光强度进行了定量检测，发现不同类型及品种之间花粉自发荧光强度存在明显差异，可作为烟草品种鉴别的重要依据。

毕玉花等[18]以非洲菊为研究对象，对其生长发育过程(P1~P6期)中外轮舌状花进行延迟荧光(DF)分析，并利用LSCM成像系统对其各期表皮细胞中叶绿素的分布和相对含量进行检测，以研究非洲菊外轮舌状花发育过程中延迟荧光改变与其叶绿素变化的关系。

项海波等[19]根据蔬菜叶绿素荧光强度将随污染的程度发生改变的原理，采用LSCM技术分析蔬菜受重金属污染后叶绿素荧光强度的变化，建立了基于LSCM技术的蔬菜重金属污染评价方法，进一步为进出口蔬菜的监管奠定了方法学和技术理论基础。

茶树荧光性绿斑病是一种普遍发生的成叶生理性病害。蒋淑媛等[20]将pH荧光探针BCECF/AM导入茶树荧光性绿斑病病叶、正常叶片切片，利用LSCM技术测定胞内pH，结果表明病害叶片胞内的pH与病害程度呈显著正相关。测定病变叶片胞内pH有利于探明病变细胞的生理变化，对阐明其发光机理以及发病机理有重要理论意义。

4LSCM在园艺植物发育学及相关领域中的应用

徐川梅等[21]利用LSCM技术，对孝顺竹雄配子体发育过程进行观察，发现大部分孝顺竹单倍体小孢子经过2次有丝分裂过程最终形成成熟的三细胞花粉粒，但约有38%的孢子不能发育成正常的花粉粒，认为这可能是孝顺竹结实率低下的原因。

朱东姿等[22]利用LSCM技术对甜樱桃品种“美早”和“布鲁克斯”的雌配子体发育过程进行了观察。将甜樱桃胚囊用戊二醛固定，脱水透明后直接采用LSCM进行观察，利用该法观察到的雌配子体发育过程与用石蜡切片法观察的一致，但是LSCM法更简便、省时、准确。

王颖等[23]利用LSCM技术对平邑甜茶与扎矮山定子杂交获得6个皱叶矮生型株系的胚胎发育过程及发育特性进行了观察与研究。结果表明，皱叶矮生型株系的胚胎发育特征是以有性生殖为主的生殖方式，与亲本扎矮山定子的胚胎发育特征较一致；与亲本平邑甜茶不同，未出现平邑甜茶胚胎发育中的复杂现象，并表现出较弱的无融合生殖能力。

5LSCM在园艺植物遗传学上的应用

LSCM技术广泛应用于核酸分子杂交方面，与传统的原位杂交技术相比，原位杂交的共聚焦技术具有操作简单、快速、结果更清晰准确的优点，而采用LSCM对样品进行双色标记和探测，尤其对小染色体原位杂交的定位特别有用，也可在基因的表达和检测方面借助LSCM技术。李国平等[24]应用LSCM技术研究油杉小孢子的发生过程，油杉样品经曙红-Hoechst 33342双染和冬青油透明后，分别用488 nm紫外光进行扫描，结果表明，在LSCM下可较好地再现油杉小孢子发生过程，清晰地显示出油杉花粉母细胞减数分裂过程中核相的变化。

阎隆飞等[25]将运用反义基因技术构建成的植物不育基因导入小麦和番茄中，获得大量转基因小麦和番茄植株，检测分析表明导入的反义肌动蛋白在雄蕊，特别是在花药和花粉中表达正确，使花药和花粉中内源肌动蛋白基因的表达得到特异性的封闭或抑制，从而导致花药和花粉细胞畸形或无活力，产生雄性不育。经LSCM观察转基因植株的花粉发现花粉粒中的微丝明显减少，而雌蕊并不受影响。

罗果等[26]为观察外源hIL-12基因在转基因马铃薯不同组织部位的表达情况，采集转基因马铃薯的茎和块茎组织进行研究，以野生马铃薯为阴性对照，用间接荧光免疫标记法、激光共聚焦显微镜观察hIL-12在转基因马铃薯不同组织中的表达情况。结果表明，经LSCM检测，转基因马铃薯茎与块茎中均有hIL-12的表达，而野生马铃薯中无hIL-12的表达。

6LSCM的应用前景与展望

近年来出现的LSCM是一种图像分析仪器，有着独特的激光扫描成像方式及精确的计算机测量定位系统，其与电子显微镜、原子力显微镜、生物质谱、核磁共振等技术不断结合，大大提高了分辨率，是普通显微镜和电子显微镜的飞跃和补充，已经深入生物学研究的各个领域。但该技术还有一些不足，如价格昂贵、对操作人员技术要求高、激发波长有限等，限制了该技术的应用。目前，该技术在药用园艺植物方面的应用也较少，但随着时间的推移，该技术在园艺植物方面的研究将有更加广阔的前景。

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收稿日期2015-12-28

作者简介王健(1986-)，男，山东东阿人，硕士，研究方向：植物学。*通讯作者，副教授，硕士生导师，从事植物学研究。

基金项目山东省农业科技成果转化项目[鲁科农(2012)65号]。

中图分类号S 126

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-007-02