有机相中脂肪酶催化合成乙酸芳樟酯的研究

胡 坤，代 斌，胡建国，李 鑫，甄长慧　(蚌埠医学院科研中心，安徽蚌埠 233000)



有机相中脂肪酶催化合成乙酸芳樟酯的研究

胡 坤，代 斌*，胡建国，李 鑫，甄长慧(蚌埠医学院科研中心，安徽蚌埠 233000)

摘要[目的]以乙酸酐和芳樟醇为底物，采用脂肪酶催化法合成乙酸芳樟酯。[方法]通过考察不同种类的脂肪酶对该反应的催化效果，研究不同种类固定化载体对该脂肪酶活性的影响，探讨固定化后的脂肪酶在有机相中催化合成乙酸芳樟酯的条件。[结果]获得了一种对该反应催化效率较高的脂肪酶Novozym 435，得出其最佳固定化条件，确定了固定化后的脂肪酶在有机相中催化合成乙酸芳樟酯的最佳反应条件：异辛烷为最佳有机溶剂，以摩尔比为1∶1.5的芳樟醇和乙酸酐为底物，底物浓度为0.5 mol/L，在45 ℃下振荡反应24 h，此条件下乙酸芳樟酯的收率较高。[结论]该反应体系的建立为今后工业生物催化法合成乙酸芳樟酯奠定了良好的基础。

关键词有机相；乙酸芳樟酯；脂肪酶；固定化

乙酸芳樟酯，又名乙酸沉香酯、乙酸里那酯，化学名称为3，7-二甲基-l，6-辛二烯-3-醇乙酸酯，有着类似薰衣草和铃兰等香精油的幽雅香气，可从薰衣草中提取获得。薰衣草在罗马时代就被广泛用作香草，被称为“香草之后”，因其功效较多，香气有着使人心旷神怡、清新舒畅的功效，自古被广泛应用于医疗和香水制作上。近代，薰衣草的主要成分乙酸芳樟酯又被广泛用于配制皂用香精、香水香精、食品香精等多种香精，在日化、烟草和食品工业中也占有十分重要的地位[1]。

近年来，随着我国日化、卷烟和食品等产业的快速发展，对乙酸芳樟酯的需求也成倍增加。但是，因为自然资源有限，从天然植物中提取乙酸芳樟酯不仅提取流程相对复杂，而且产量也远不能满足需求，所以采用化学方法对乙酸芳樟酯的合成进行研究和提高乙酸芳樟酯的产率，具有着重要的经济价值和社会效益。

有机相酶催化技术具有广阔的应用前景，随着化学工艺的发展，有机相的酶催化动力学和酶固定化技术等都越来越受到重视；有机相中脂肪酶催化不仅可以用于油脂的水解来制备脂肪酸，而且还可用于对某些低质油脂的改良。例如，可用于橄榄油与硬脂酸的脂交换，以制备类可可脂[2]。用于催化油脂和甘油之间的转酯化反应，或脂肪酸和甘油的酯化反应，以制备单酰甘油脂[3]。另外，还可利用脂肪酶的区域选择性，催化高级脂肪酸和糖分子上的特定羟基发生酯化反应，从而获得采用一般化学方法难以制得的单酰糖酯[4]。此外，以脱氢芳樟醇为原料，采用先酯化后加氢的工艺路线制备乙酸芳樟酯，结果表明制备乙酸芳樟酯的工艺具有选择性高、成本低的优势[5]。由此可见，有机相酶催化技术工业上的应用将使传统的化学工业朝着节约资源和能源的方向发展，具有非常广阔诱人的前景。笔者在有机相中以乙酸酐和芳樟醇为底物，采用脂肪酶催化法合成乙酸芳樟酯，并比较了不同种类固定化载体对该脂肪酶活性的影响，确定最佳的固定化条件，并确定了固定化脂肪酶在有机相中催化合成乙酸芳樟酯的最佳条件，以期为其今后工业化生产奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1试验材料与耗材。 米黑毛霉(Mucormiehei)，购自Novo Nordisk 公司；D101大孔树脂(D101 macroporous resin)，购自天津市光复化工研究所；节杆菌Y-605(Arthrobacter Y-605)，由蚌埠医学院科研中心实验室分离并筛选；壳聚糖(Chitosan)，购自Sigma公司；脂肪酶(PocrinePanereasliPase(PPL)，购自Sigma公司；橄榄油(Olive oil)，购自国药化学试剂有限公司；南极假丝酵母脂肪酶B(CdidaetieliPase B)，购自诺维信公司；磷酸氢二钾和甘氨酸，均为分析纯，购自西安化学试剂厂；乙酸酐，分析纯，购自中国医药上海化学试剂公司；50%戊二醛，分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂；芳樟醇，ω(芳樟醇)>97%，购自上海石化股份有限公司化工研究所；试验中使用的氢氧化钠、聚乙烯醇等需经3A分子筛除水。

1.1.2仪器。回转式恒温调速摇瓶柜，为上海智诚分析仪器制造厂产品；恒温磁力搅拌器，为上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司产品；高速冷冻离心机，为德国Eppendorf公司产品；Perkinelmer高效气相色谱，为美国珀金埃尓默仪器有限公司产品；冷冻干燥机，为德国Christ公司产品。

1.2试验方法

1.2.1脂肪酶固定化。固定化方法是使酶更广泛、更有效应用的一种重要手段。目前，国际上制备固定化酶的方法种类较多，比较成熟的固定化方法可大致分为吸附法[6]、交联法[7]、包埋法[8]、共价结合法[9]4类。综合考虑酶的制备过程、固定化酶状态和载体来源等因素，对比后选择采用涂布法和吸附法来进行脂肪酶的固定化研究。①涂布法。取用一定量酶液，加入经预处理的载体，搅拌均匀后30 ℃真空干燥后得到固定化酶。②吸附法。取用一定量酶液，加入经预处理的载体，先经过30 ℃摇床中振荡4 h后抽滤，然后用缓冲溶液洗涤、干燥得到固定化酶。

1.2.2脂肪酶水解活力单位的测定。首先脂肪酶国际单位定义为：在测定条件下每分钟释放出1 μg分子脂肪酸的酶量。脂肪酶活力单位的测定选用聚乙烯醇橄榄油乳化液法[10]：用4 mL 4%的PVA(聚合度1750)橄榄油乳化液和5 mL的0.025 mol/L pH 7.0缓冲液1 mL酶液，在37 ℃下反应15 min，加入15 mL的95%乙醇终止反应，结果用0.05 mol/L NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。

1.2.3固定化载体的选择。载体对固定化脂肪酶活力的影响较大，用于固定化脂肪酶的可用载体也非常多。选用大孔树脂、硅藻土、活性炭、壳聚糖作为初步载体进行筛选，通过测定酶活力发现大孔树脂的酶活明显高于其他3种载体。因此，试验中主要用大孔树脂作为载体进行其他条件的筛选。

1.2.4脂肪酶合成酯的反应体系。在100 mL具塞三角瓶中加入反应底物乙酸酐和芳樟醇，反应底物乙酸酐和芳樟醇的摩尔比为1.2～1.5，同时加入有机溶剂，使底物浓度保持在0.2～1.0 mol/L，在33～50 ℃下振荡反应3～36 h。

1.2.5气相色谱检测产物的组成。使用美国Perkinelmer气相色谱仪，DB-1毛细管柱，氢火焰FID检测器，氮气为载气，柱温条件为80 ℃，保持3 min，然后以15 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持2 min。

2结果与分析

2.1固定化条件的筛选

2.1.1载体加入量对固定化效果的影响。在粗酶量为400 mg、pH为8.0、固定化温度30 ℃、浓度0.1 mol/L 的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，比较不同大孔树脂加入量对酶固定化效果的影响。从图1可以看出，随着载体用量的不断增加，固定化酶的水解酶活呈先增大后减小的趋势，因此选择最佳的大孔树脂加入量为2.5 mg/mg粗酶。

2.1.2缓冲液pH对酶固定化效果的影响。选用最佳大孔树脂用量，以0.1 mol/L K2HPO4-KH2PO4为缓冲溶液，考察了不同pH的磷酸盐缓冲溶液对酶固定化效果的影响。从图2可以看出，当pH为6.4时，酶固定化效果最好。

2.1.3不同缓冲溶液对酶固定化效果的影响。分别用K2HPO4-KH2PO4、甘氨酸-NaOH和 Na2HPO4-KH2PO4为缓冲溶液，在其他条件相同的情况下，比较3种缓冲溶液对吸附效果的不同影响。通过测定固定化酶水解活力后发现，用K2HPO4-KH2PO4的缓冲溶液来固定化脂肪酶效果最好。

2.2脂肪酶在水相和不同有机溶剂相中合成芳樟酯能力的比较用Novozym 435脂肪酶在同样条件下于正庚烷、异辛烷、正己烷、正戊烷和水中合成己酸芳樟酯比较反应转化率。从图3可以看出，在异辛烷中催化合成的己酸芳樟酯转化率和反应速度都高于在其他有机溶剂中的反应结果，且远高于在水相中的反应结果。究其原因，这是由于在有机相中酯化反应热力学平衡更容易向着合成酯的方向移动[11]。

2.3合成乙酸芳樟酯的最佳脂肪酶筛选由于酶的专一性不同，不同酶对反应的催化效率也不同。比较了4种不同微生物来源的脂肪酶PPL、Y-605、MML和Novozym435，研究合成乙酸芳樟酯的结果。从图4可以看出，由于不同的脂肪酶的酯活力不同，因此合成乙酸方樟酯转化率也是不同的。其中，以Novozym435和MML酯化活力较高。

2.4不同试验条件对合成乙酸芳樟酯的影响以异辛烷为有机溶剂，在45 ℃条件下振荡反应，通过正交试验来考察不同试验条件对合成乙酸芳樟酯的影响。通过高效气相色谱实时检测，得到乙酸芳樟酯的实时转化率，发现底物浓度是最主要的影响因素，其次为底物摩尔比，酶加入量和水含量对试验的影响相对较小。随着反应时间的不断增加，乙酸芳樟酯的转化率也在不断提高，但是24～36 h内乙酸芳樟酯的转化率已无明显提高，36 h的转化率反而有所降低(表1)。因此，为了减少能耗和提高效率，选择24 h作为最佳合成时间。

表1乙酸芳樟酯实时转化率检测

Table 1Detection of real-time conversion rate of linalyl acetate

3结论与讨论

大孔树脂是比较理想的固定化酶载体，该试验以K2HPO4-KH2PO4为缓冲溶液，当pH为6.4，树脂与酶的质量比为2.5∶1时，可以达到最佳固定化效果。通过高效气相色谱对乙酸芳樟酯转化率的检测，笔者考察了固定化后的脂肪酶在有机相中催化合成乙酸芳樟酯的条件，确定其最佳反应条件：当以异辛烷作为有机溶剂，乙酸酐和芳樟醇摩尔比为1.5∶1，底物浓度为0.5 mol/L，在45 ℃条件下摇床中振荡反应24 h，此条件下得到乙酸芳樟酯的收率较高。同时，脂肪酶的选择和分批加入能较大程度地减少因酶失活对转化率产生的影响。此反应的底物乙酸酐为强脱水剂，加入的脂肪酶容易由于乙酸酐的脱水作用，脱去脂肪酶周围的水分包裹层，导致脂肪酶失活。为了减少因酶失活对转化率的影响，采用将脂肪酶分批加入的方法，来保证新酶的持续供给。该试验中，采用将脂肪酶分3次加入的方法，取得较好的效果。

该试验利用微生物酶来催化乙酸芳樟酯合成，为今后工业生物催化法合成乙酸芳樟酯奠定良好的基础。目前，以芳樟醇为原料合成乙酸芳樟酯，主要分为乙烯酮法和乙酸酐酯化法。乙烯酮法由于乙烯酮有毒，化学性质活泼，反应条件要求高[12]，所以研究较多的是乙酸酐酯化法。笔者在此基础上进一步细化与改进了反应条件，同时选用比较合适的微生物酶作为催化剂。芳樟醇酯化反应常用的催化剂有磺基水杨酸、磷钨酸催化剂等，这些催化剂往往存在转化率较低、反应选择性不高和反应效果较差的缺点，例如有试验在磺基水杨酸为催化剂的条件下得到的结果转化率较低，同时副反应较多；以磷钨酸为催化剂时，需要在较高温度下进行长时间反应，能耗相对较高。笔者对以上缺点有了相应改进，取得了较好的效果，但是转化率依然不够理想，今后研究中应对多种不同脂肪酶进行再次筛选，寻求更适合于乙酸芳樟酯合成的酶。

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Research on Linalyl Acetate Catalyzed by Lipase in Organic Solvent

HU Kun, DAI Bin*, HU Jian-guo et al

(Bengbu Medical College, Bengbu, Anhui 233000)

Key wordsOrganic solvent; Linalyl acetate; Lipase; Immobilization

Abstract[Objective] To synthesize linalyl acetate by catalyzing substrate of acetic anhydride and linalool. [Method] Through investigating the catalysis effect of different kinds of lipases, the effect of different kinds of fixed carriers on the lipase activity were studied, the conditions in which the ester of acetic anhydride and linalool was catalyzed by the fixed lipase in organic solvent were explored. [Result] A lipase Novozym 435 which can catalyze the reaction most efficiently was obtained, as well as the best conditions for the fixation. The best conditions for the reaction were as follows: the best organic solvent must be isooctane; substrate of acetic anhydride and linalool should be 1∶1.5 by Mole; the concentration of the substrate must be 0.5 mol/L; the temperature should be 45 ℃; shaking reaction for 24 h. Under these conditions we can get linalyl acetate as much as possible. [Conclusion] The reaction system lays a solid foundation for synthesizing linalyl acetate in the bio-industry area in the future.

基金项目教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-04-0988)；蚌埠医学院重点科研项目(BYKY1494skZD)。

作者简介胡坤(1984-)，男，山东临沂人，助教，硕士，从事植物化学研究。*通讯作者，教授，博士，从事有机化学方面的研究。

收稿日期2016-01-22

中图分类号S 132

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-001-03