补益营卫方对衰老小鼠皮肤端粒酶表达的影响

司晓伟 周小平

[摘要]目的：观察补益营卫方对衰老小鼠皮肤端粒酶表达的影响，探讨补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。方法：以自然衰老小鼠为模型，制备石蜡切片，应用免疫组化法对端粒酶的表达进行分析。结果：衰老小鼠皮肤中端粒酶的表达水平较年轻小鼠低，且有显著性差异（P<0.05）。应用补益营卫方高、中、低剂量组处理后，可显著提高端粒酶的表达，与老龄模型组比较有统计学意义（P<0.05）。三个剂量组相比，低剂量组对端粒酶表达水平的影响优于其它两个剂量组（P<0.01），中剂量组和高剂量组相比没有明显差异（P>0.05）。结论：补益营卫方通过促进衰老皮肤端粒酶的表达，起到延缓皮肤衰老作用。

[关键词]营卫；皮肤衰老；端粒酶；中医药；机制

[中图分类号]Q591

[文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）01-0041-03

中医理论认为营卫具有“熏肤、充身、泽毛、温分肉、充皮肤、肥腠理、司开合”的作用，其与皮肤的生理和病理有密切关系。随着年龄的增加，人体气血渐衰，营卫亦显不足，皮肤显现衰老的表象。端粒酶（Telomerase）是一种在细胞中负责端粒延长的酶，端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，许多研究表明，端粒酶除具有合成端粒重复序列，防止细胞复制性衰老的作用以外，还具有独立于端粒外的抗凋亡作用和调节细胞生存的作用。本实验拟通过对衰老小鼠皮肤端粒酶的影响，探讨补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康清洁级C57BL/6种雌性小鼠50只，其中3月龄10只，重量（20±2）g，14月龄40只，重量（28±3）g，实验动物合格证号：SYXK（苏）2011-0035，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。饲养于宁夏医科大学动物实验中心。

1.2 实验药物

补益营卫方由人参、甘草等组成，购自宁夏医科大学中医门诊部，常规水煎2次，合并滤液浓缩至生药含量1g/ml，4℃冷藏保存。灌胃时用生理盐水稀释至所需浓度。

1.3 主要实验仪器与实验试剂

LEICA RM2245石蜡切片机（德国徕卡公司），LEICAEG1150C组织包埋机（德国徕卡公司），Glanz WD800微波炉（广东格兰仕有限公司），Olympus光学显微镜（日本OLYMPUS公司）等均有宁夏医科大学解剖实验室提供。端粒酶相关一抗和二抗（abcam公司），DAB显色剂（中杉生物有限公司）等。

1.4 分组、给药、取材

清洁级C57BL/6种雌性小鼠50只，其中3月龄10只，设为年轻组；14月龄40只，随机分为4组，每组10只，分别设为老龄模型组、补益营卫高剂量组、中剂量组和低剂量组。补益营卫方高、中、低剂量组每天分别按6g/kg、39/kg、1.5g/kg的剂量灌胃给药，每周禁食称重一次，连续六周。六周后，脱臼处死动物，剪下背部皮肤，尽可能剪去背毛，取1.Ocm×1.Ocm，分成数份，置于4%多聚甲醛中固定，将固定标本取出，常规脱水，透明，浸蜡后包埋，石蜡切片厚度为5μm。

1.5 实验方法

本次实验通过免疫组化法对小鼠皮肤端粒酶表达的检测，具体过程如下：①5μm石蜡切片脱腊入水；②枸橼酸缓冲液加热至90℃，微波修复Imin后冷却，移至PBS；③PBS漂洗5min×3次；④加20%正常牛血清，室温留置30min；⑤加100μlTdT反应混合液，置湿盒中，37℃反应90min；⑥PBS漂洗5min×3次；⑦浸入0.3%过氧化氢甲醇液，室温阻断lOmin；⑧PBS漂洗5min×3次；⑨加POD转化剂，37℃反应30min；⑩PBS漂洗5min×3次； 11.加100μlDAB显色；12.苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。

1.6 指标测定

光镜下细胞核呈棕色颗粒为阳性细胞。每张切片在高倍镜视野下选择对照背景较好，阳性细胞表达最强的染色部位，细胞分布较为均匀的10个视野，应用Image-ProPlus 6.0进行图像分析，用光密度值评价端粒酶。

1.7 统计学处理

应用SPSSII.5进行数据统计分析，实验数据用x±s表示，样本均值比较采用单因素方差分析，方差分析采用LSD法比较各组均数间的差异。显著性水平设为a=0.05，P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

见图1。结果显示，在光学显微镜下，端粒酶表达的阳性细胞的胞核呈棕黄色，阴性细胞呈淡蓝色。年轻组小鼠皮肤端粒酶表达强，主要分布在表皮基底层及毛囊部位；而老龄模型组端粒酶的表达则明显较弱，两组之间有显著差异（P<0.05）。应用补益营卫方不同剂量组处理后，可显著提高衰老小鼠皮肤端粒酶的表达，与老龄模型组比较有显著差异（P<0.05）。补益营卫方三个剂量相比，低剂量组对端粒酶表达水平的影响优于其它两个剂量组，并有显著统计学意义（P<0.01），中剂量组和高剂量组之间无统计学差异（P>0.05）。见表1。

3 讨论

随着人类社会的发展和进步，人们生活质量逐渐提高，对延缓皮肤衰老的要求越来越迫切。皮肤衰老作为机体衰老的重要组成部分，最先表现于外，衰老的皮肤外观不但影响容貌靓丽，亦影响社交，因此预防和延缓皮肤衰老已成为美容医学研究的热点。中医药在数千年的发展中积累了丰富的抗衰老理论和经验，《伤寒论·平脉法》第69条说：“寸口脉微而涩，微者卫气衰，涩者荣气不足，卫气衰，面色黄，荣气不足，面色青。”指出营卫充盛，则肌肉健壮，容光焕发，没有衰老之象；反之，营卫不足，则面色青黄，衰象显露。因此皮肤的健康，疾病以及衰老与营卫密切相关。

笔者从《伤寒论》和《金匮要略》中与营卫相关方剂的挖掘、整理与分析，从以“营气不足”导致身疼痛为病机的桂枝新加汤证中选取益营气的人参，从治虚劳的黄芪建中汤证选取益卫的生黄芪，再加益气调和药性的炙甘草组成了补益营卫方。本实验从补益营卫的角度出发，探讨补益营卫方对衰老皮肤中端粒酶的表达影响。

近年研究表明，端粒和端粒酶在细胞复制性衰老中起着重要作用。正常体细胞端粒的长度是有限度的，随着年龄的增长和细胞分裂次数的增多，端粒会逐渐缩短，一般丢失速度为50-200bp/次。端粒长度决定了细胞的分裂次数，它作为有丝分裂的“时钟”，调控着细胞的复制寿命，超过分裂极限后细胞自然衰老死亡。

端粒酶是一种能延长端粒末端、由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶。端粒酶结构组成主要包括三部分：人类端粒酶RNA基因（human telomerase RNA component，hTerc），人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTert），Dyskerin。有研究发现，激活端粒酶活性可以阻止端粒缩短引起的衰老，延缓组织老化并提升机体的健康状况及生命长度。国内外研究表明，端粒酶与衰老有密切的联系，因此对端粒酶的检测对抗衰老有着重大意义。

本研究采用免疫组化技术通过对衰老小鼠皮肤端粒酶的表达，探究补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。实验结果显示，衰老小鼠皮肤中端粒酶的表达水平比年轻小鼠的表达水平明显下降，两者之间有显著统计学意义（P<0.05）。与国内外的报道相符。经补益营卫方高、中、低剂量组干预，对衰老小鼠皮肤端粒酶的表达有促进作用，与老龄模型组比较有显著差异（P0.05）。

综上所述，可以看出补益营卫方通过促进衰老皮肤端粒酶的表达而延缓皮肤衰老。