苹果多酚对Caco- 2细胞和LDL抗氧化作用的研究

张桂芝，籍保平，张迪（.中山火炬职业技术学院，广东中山58436；.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京00083）



苹果多酚对Caco- 2细胞和LDL抗氧化作用的研究

张桂芝1，籍保平2，张迪2
（1.中山火炬职业技术学院，广东中山528436；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

摘要：采用细胞氧化损伤模型和Cu2＋诱导的低密度脂蛋白（LDL）氧化修饰模型来评价不同品种中苹果多酚的抗氧化作用。结果表明H2O2浓度为10mmol/L时对细胞模型损伤程度比较适中。富士中苹果多酚对损伤的Caco-2细胞的保护作用最强，其中富士、国光、金冠和王林处理后细胞产MDA量分别是对照的20 %、33 %、40 %和60 %；苹果多酚对LDL的氧化修饰具有显著的抑制作用，除了王林多酚外，富士、国光和金冠均能极显著地延长LDL氧化的延滞时间，其中富士苹果多酚的作用最强是对照延滞阶段时间的7倍，国光和金冠苹果次之分别是对照延滞时间的4倍和3倍。

关键词：苹果多酚；Caco-2细胞；LDL氧化；抗氧化

近年来流行病学研究表明，食用苹果和人类许多慢性疾病的发生呈负相关。苹果是多酚来源的一个重要原料。不同品种的苹果其抗氧化活性不同。

目前天然抗氧化剂的实验筛选主要利用ESR和化学发光等技术[1]。化学评价体系具有快速、灵敏、重现性好的特点，但其主要缺点是无法模拟体内的抗氧化效果，因此现在越来越多的国内外研究者开始通过细胞体系来评价抗氧化成分对细胞的保护作用。Andrea等[2]发现在Caco-2细胞模型中有机柑橘汁相对于非有机柑橘汁表现出更强的抗氧化能力。Gunji[3]发现热带海藻提取物能够提高过氧化氢处理的Caco-2的存活率。Kuo等[4]研究了黄酮类物质对于肠癌细胞的抑制增殖作用、黄酮在Caco-2细胞中的积累和跨膜运输作用[5]、黄酮对Caco-2细胞中抗氧化蛋白的作用、黄酮结构对于抑制Caco-2细胞脂质过氧化的影响[6]。

当体内产生过多活性氧自由基时，血浆脂蛋白存在着明显的氧化应激，LDL极易转化为氧化低密度脂蛋白（OX-LDL），它是动脉粥样硬化（AS）发生和发展的关键因素之一[7]。因此本实验从抗氧化生物体系的角度选择两种不同的抗氧化评价模型，即细胞氧化损伤模型和Cu2＋离子诱导的LDL氧化修饰模型来评价苹果多酚的抗氧化作用，为进一步研究苹果多酚的功能提供一定依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1细胞来源

Caco-2细胞来自ATCC：美国菌种保藏中心。

1.1.2苹果多酚的制备[8]

以王林、富士、国光和金冠为原料。称取约50 g预冷的苹果加200 mL预冷的无水乙醇，打浆后浸提30 min，抽滤，然后于40℃旋蒸仪浓缩，浓缩液冻干备用。将苹果多酚溶于PBS（pH为7.2）中，根据细胞毒性试验，确定用于培养Caco-2细胞的苹果多酚终浓度为50 μg/mL。

1.1.3低密度脂蛋白

低密度脂蛋白（1.4 mg/mL）：购于中国协和医科大学细胞中心，用时以pH 7.4的PBS稀释至250 μg/mL。

1.1.4试剂

DMEM培养基、胎牛血清FBS：Gibco公司；胰蛋白酶、MTT：Sigma分装；二甲基亚砜：DMSO；MDA测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.5仪器

XDOS-1B倒置生物显微镜，HH.CP-01型二氧化碳培养箱，TDL-40B台式离心机，Multiskan MK3型自动酶标分析仪，WMV-1000微视摄像头系统。

1.2方法

1.2.1 Caco-2细胞培养与H2O2损伤

Caco-2细胞在含青链霉素和10 %胎牛血清的DMEM完全培养液中，于37℃，5 %CO2培养箱中培养当细胞达到80 %融合后，用0.25 %胰蛋白酶消化，以密度为5.0×104接种于96孔板中，培养7 d后（细胞密度约为107），用H2O2进行损伤3 h。

1.2.2 MTT试验

将完成H2O2损伤的Caco-2细胞取出，弃去细胞上清液，用PBS缓冲液清洗细胞两次，然后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）和200 μL无酚红培养基培养4 h后弃去培养液，加入150 μL DMSO震荡20 min后于550 nm下处测定其吸光值。

1.2.3丙二醛（MDA）测定

将密度为5.0×104的细胞接种于24孔板中培养7 d后每孔用1 000 μL苹果多酚作用24 h后，弃去细胞上清液，用PBS清洗细胞两次，然后每孔加入10 mmol/L 的H2O2（按1∶1体积比溶于不完全培养基）1 000 μL损伤3 h，然后取细胞上清液于532 nm进行MDA含量的测定。

MDA浓度计算公式：

1.2.4 Cu2+诱导的LDL的氧化方法[9]

在试管中分别加入250 μg/mL LDL 200 μL、200 μL样品溶液、1 400 μL的PBS混匀放入37℃的水浴中预热10 min。随后加入200 μL的硫酸铜溶液使其最终浓度为2.5 μmol/L引发氧化反应。其中，空白（不含Cu2+的LDL反应体系）以PBS代替样品溶液和硫酸铜溶液，对照以PBS代替样品溶液。反应引发后开始计时，每隔15 min于234 nm测定一次吸光值。本试验采取延滞时间来评估样品对LDL氧化易感性的影响。延滞时间定义为氧化曲线的最大斜率与平行于x轴的初始吸光值轴的截距所得的时间。

2结果与分析

2.1 Caco-2细胞的H2O2损伤

H2O2对细胞损伤与浓度有关，本试验选取不同浓度的H2O2损伤细胞3 h后用MTT法测细胞活力其结果见表1。

表1 H2O2浓度对Caco-2细胞损伤的影响（n=6）Table 1 Effect of H2O2treatment on Caco-2 cells

从表1中可以看出随着H2O2浓度的降低其对细胞损伤程度也减小，当H2O2浓度为10 mmol/L时对细胞的损伤程度比较适中，因此后面试验选择10 mmol/L为细胞损伤的浓度。

2.2细胞损伤丙二醛（MDA）测定

本试验采用提前给药方式研究苹果多酚对细胞氧化应激损伤的保护作用。结果如图1。

从图1中可以看出4种苹果多酚处理比对照组的MDA显著降低，说明苹果中多酚能显著降低细胞氧化应激的损伤作用，其中富士、国光、金冠和王林处理后细胞产MDA量分别是对照的20 %、33 %、40 %和60%。因此富士苹果多酚对细胞的保护作用最强，国光和金冠次之，王林的作用较弱。

图1苹果多酚对H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤的影响Fig.1 Effect of apple polyphenols on H2O2-induced oxidative stress in Caco-2 cells

2.3苹果多酚抗低密度脂蛋白氧化作用

Cu2+氧化修饰LDL是通过Fenton反应后生成的自由基作用于LDL中的PUFAS（多聚不饱和脂肪酸）PUFAS被氧化形成共轭双烯于波长234 nm处有最大吸收峰。当体系中含有外源的抗氧化剂时，会推迟延滞阶段的出现，从图2可以看出苹果中的酚类物质有效地推迟了LDL氧化修饰的启动时间，说明苹果多酚对LDL的氧化修饰具有抑制作用，此作用对防治心脑血管疾病具有尤其重要意义。

图2苹果多酚对Cu2+诱导的LDL氧化的影响Fig.2 Effect of apple polyphenols treatment on LDL oxidation by Cu2+

从延滞时间表2可以看出，与对照相比除了王林多酚外，富士、国光和金冠多酚均能显著地延长LDL氧化的延滞时间，其中富士苹果多酚的作用最强是对照延滞阶段时间的7倍，国光和金冠苹果次之分别为4倍和3倍。，

表2苹果多酚对LDL氧化的延滞时间Table 2 Delay time of LDL oxidation by apple polyphenols

3　结论

结果表明苹果多酚能有效清除H2O2诱导的活性氧自由基，避免Caco-2细胞损伤，并且对LDL的氧化修饰具有显著的抑制作用，可以看出苹果多酚能够清除体内产生的过多的活性氧自由基，阻断体内氧自由基的反应链的LDL氧化修饰作用因此可能对防治心脑血管疾病将具有重要意义。

参考文献：

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[2] Andrea T, Silvana H, Cristina A. Antioxidant effectiveness of organically and non-organically grownred oranges in cell culture systems [J]. Eur J Nutri, 2006(3): 41-45

[3] Gunji S. Effects of extracts from tropical seaweeds on DPPH radicals and Caco-2 cells treated with hydrogen peroxide[J]. Food Sci Technol Res, 2007(13): 275-279

[4] Kuo S M. Antiproliferative potency of structurally distinct dietary flavonoids on human colon cancer cells[J]. Cancer Letters,1996, 110 (1): 41-48

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Study on Antioxidant of Apple Polyphenols on Oxidative Stress Caco-2 Cellculture Mode and Oxidized Low Density Lipoproteins

ZHANG Gui-zhi1，JI Bao-ping2，ZHANG Di2
（1. Zhongshan Torch Polytechnic，Zhongshan 528436，Guangdong，China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract：The antioxidant and protective properties of apple polyphenols were investigated using oxidative stress Caco-2 cellculture mode and oxidized low density lipoproteins induced Cu2＋. The results showed that H2O2-induced oxidative stress was investigated using Caco-2 cells and 10 mmol/L H2O2was moderate. Apple polyphenols could protecte Caco-2 cells from oxidative stress. The MDA contents of cells were approximately 20 %，33 %，40 % and 60 % as in those of the control group for Fuji，Guoguang，Golden Delicious and Wanglin，respectively. The polyphenols of Fuji，Guoguang and Golden Deliciou apple could effectively prevent oxidation of LDL. The lag phages of LDL oxidation curves were prolonged over 7，4 and 3 times longer than that of the control group for Fuji，Guoguang and Golden Delicious，respectively.

Key words：apple polyphenols；Caco-2 cell；oxidized LDL；antioxidant

收稿日期：2014-07-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.011

作者简介：张桂芝（1973—），女（汉），副教授，博士，研究方向：食品科学。