MTA2基因敲除抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖和迁移能力

翁 伟，徐元宏，宋晓菲

MTA2基因敲除抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖和迁移能力

翁 伟1，徐元宏1，宋晓菲2

目的探讨人乳腺癌MDA-MB-231细胞MTA2基因敲减后，人乳腺癌生物学特性的改变。方法体外化学合成MTA2序列特异性的shRNA，经慢病毒转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231后，挑选出稳定低表达MTA2的细胞株。收集敲除了MTA2的细胞，定量实时荧光PCR（qRT-PCR）、Western blot法分别检测MTA2 mRNA和蛋白的抑制水平。采用CCK-8法、Transwell迁移实验以及划痕实验观察敲减MTA2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移能力的影响，体外利用裸鼠荷瘤实验进一步观察MTA2敲除后乳腺癌生长、转移能力的变化。结果MTA2的shRNA有效地抑制了MTA2 mRNA和蛋白水平（P＜0.05）。shRNA干扰MTA2组的MDA-MB-231细胞，细胞增殖能力显著降低（P＜0.05）；细胞侵袭、迁移能力明显降低（P＜0.05）；裸鼠荷瘤实验中MTA2下调组瘤体明显更小，而且肺部转移灶明显减少（P＜0.05）。结论MTA2被稳定干扰后，乳腺癌的某些恶性生物学行为能有效抑制；表明MTA2与乳腺癌的生长、转移有一定关系。

RNA干扰；MTA2；乳腺癌；生长；转移

转移相关基因家族（metastasis-associated gene family，MTA）家族包含3个成员，MTA1、MTA2和MTA3。MTA1在很多肿瘤中高表达，如乳腺癌、食管癌、胰腺癌和肝细胞肝癌等［1］，并且参与了肿瘤的转移和浸润［2-3］。MTA2在蛋白结构上与MTA1具有很高的同源性，并且与核小体重构及组蛋白去乙酰化酶NuDR复合物有关［4-5］。因此MTA2也可能参与了实体肿瘤的生长及转移。RNA干扰技术可以有效地在转录后水平沉默基因，是一种具有高度特异性、高效性以及自我维持能力的技术，目前已成为基因沉默疗法更为理想的工具［6］。该研究组体外化学合成MTA2的shRNA，进行慢病毒包装，构建稳定低表达MTA2基因的细胞株MDA-MB-231。通过对该细胞系与未感染慢病毒的细胞进行细胞增殖和转移能力的对比，以及裸鼠荷瘤实验中两组裸鼠瘤体大小及肺部转移灶的差别，观察MTA2干扰后人乳腺癌生物学特性的改变。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人乳腺癌细胞系MDA-MB-231（中科院细胞库）；MTA2、β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；RNA TRIzol（美国Invitrogen公司）；PrimerScript RT reagent Kit、SYBR Premix EX TagTM试剂（日本TaKaRa公司）；小鼠抗人单克隆抗体MTA2、β-actin以及羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；NC shRNA以及特异性干扰MTA2的shRNA序列由上海吉凯公司合成；MTA2的shRNA序列为5′-CCCTCTTGAATGAGACAGATACTCGAGTATCTGT CTCATTCAAGAGGG-3'；Transwell小室（美国Corning公司）；Matrigel胶（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1定量实时荧光PCR（qRT-PCR）法检测MTA2的mRNA表达 转染后48 h收集细胞，按TRIzol试剂说明书提取总RNA，经PrimeScript RT reagent Kit合成cDNA。然后使用SYBR Premix EXTaqTM试剂，进行荧光PCR定量检测。MTA2上游引物：5′-TGTACCGGGTGGGAGATTAC-3′，下游引物：5′-TGAGGCTACTAGAAATGTCCCTG-3′。β-actin为内参，上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反应条件为：94℃预变性3 s，94℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环，空白对照组与实验组及阴性对照组的比较以MTA2荧光定量结果的Ct值减去β-actin的Ct值得ΔCt，以空白对照组RNA的ΔCt作为矫正数，计算2-ΔΔCt值，以2-ΔΔCt值为MTA2基因的相对表达量。

1.2.2Western blot法检测 用RIPA和PMSF提取转染48 h的各组培养细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。经12%SDS-PAGE胶电泳后转膜，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，加一抗4℃孵育过夜。次日加二抗37℃温育1 h，ECL发光液显色。以β-actin为内参。

1.2.3荧光显微镜观察转染效率 参照吉凯基因提供的说明书，在转染后8 h荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.4CCK-8法检测细胞增殖能力 正常和感染了病毒的MDA-MB-231细胞分别混悬，按5×103个/孔接种于96孔板。分别于培养后1、2、3、4、5 d为检测点。每次检测前，在培养液中每孔加入10μl CCK-8试剂，37℃温箱孵育2 h，然后用酶标仪检测450 nm处吸光度值。吸光度值代表细胞增殖情况。1.2.5划痕试验 取对数生长期MDA-MB-231细胞，按1×105个孔接种于6孔板，温育24 h后分别加入浓度50 nmol含有Lv-shNC（阳性对照组）或Lv-shMTA2（实验组）的培养基，继续培养24 h后细胞已铺满6孔板，利用枪头尖在细胞培养液表面划一条划痕（长约为2 cm），继续培养12、24 h后镜下观察各组MDA-MB-231细胞迁移变化情况。

1.2.6Transwell侵袭试验 将Matrigel胶（50μl/孔）均匀地铺在Transwell小室膜上，收集转染48 h后的各组细胞2×105个，用200μl无血清1640培养液稀释后接种到小室中，将小室置于加有600μl 15%FBS 1640培养液的24孔板内，37℃、5%CO2孵育72 h后取出小室，小心擦掉小室细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛固定，Giemsa染色，显微镜下计数5个视野的细胞数，求出每个视野的平均穿膜细胞数。

1.2.7裸鼠荷瘤实验 将分别感染了Lv-shNC和Lv-shMTA2病毒颗粒的MDA-MB-231细胞混悬，以200μl/支的细胞悬液注射入乳腺脂肪垫。两组裸鼠除注射的细胞悬液不同外，操作一致。以后每隔3 d检测一次裸鼠荷瘤的瘤体大小。到第30天将两组裸鼠安乐死。分别解剖，观察计数肺部转移灶情况。

1.3 统计学处理应用SPSS 15.0软件进行分析，计量资料以-x±s表示。组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 qRT-PCR及Westernblot法检测shRNA干扰MTA2基因及蛋白的表达分别感染了含LvshNC和Lv-shMTA2的病毒颗粒转MDA-MB-231细胞内，当细胞生长密度达到约70%时，在荧光显微镜下观察：计数100个细胞，其中有绿色荧光的约占80%。见图1。转染后48 h分别收集细胞的总RNA和总蛋白，经qRT-PCR分析可见实验组MTA2相对量（1.090±0.098）较阴性对照组（0.205± 0.004）显著降低（t=20.18，P＜0.05）。见图2。Western blot法检测实验组和阴性对照组MTA2蛋白水平也表明，实验组的MTA2水平显著降低。见图3。提示MTA2在人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞内被明显敲除。

2.2 MTA2干扰后MDA-MB-231细胞增殖能力检测CCK-8法显示，阴性对照组与实验组在第二个监测点（第2天）时开始出现明显差异，表现为实验组细胞增殖能力明显降低，到第5天时实验组细胞吸光度值为（4.67±0.09），而阴性对照组为（2.47±0.12），实验组约为阴性对照组细胞活力的一半（F=9.220，P＜0.05）。见图4。

2.3 MTA2敲除后细胞侵袭、迁移能力的变化划痕试验显示，随着时间的推移，阴性对照组愈合速度较实验组快（图5）；Transwell迁移试验显示，在高倍镜视野下，阴性对照组的细胞数目显著高于实验组［（591.0±32.1）vs（237.0±20.4），P＜0.05］，见图6。因此，MTA2被敲减后，MDA-MB-231细胞的侵袭、迁移能力明显降低。

2.4 MTA2干扰后肿瘤大小及肺部转移灶的改变

为了在体内研究MTA2干扰后乳腺癌生长的改变以及乳腺癌转移到肺部的转移灶变化情况，进行了裸鼠荷瘤实验。结果表明，转染了shMTA2后，小鼠负荷的肿瘤大小明显较阴性对照组小。而在计数肺部转移灶时显示，阴性对照组有4只裸鼠出现了肺部转移灶（4/6），这4只裸鼠肺部转移灶个数分别为32、45、15、40个。实验组6只裸鼠则有3只出现了肺部转移灶（3/6），3只裸鼠肺部转移灶个数分别为9、10、4个。说明MTA2干扰后，乳腺癌细胞的肺转移能力也明显被抑制（P＜0.05），见图7。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国位居女性恶性肿瘤发生率的首位。据GLOBOCAN 2008统计，乳腺癌新发病例占2011年所有肿瘤的23%，并且占所有肿瘤致死病例的14%［7］。可见，乳腺癌严重威胁女性的健康，因此探索乳腺癌的发病机制及寻求临床治疗的分子靶点对乳腺癌的诊断及防治有重要意义。目前RNA技术是分子水平研究疾病的常用手段，RNA干扰技术的发现及其应用为乳腺癌的基因治疗带来了新的思路［6］。

肿瘤转移是目前肿瘤治疗的关键障碍。肿瘤的转移包括很多步骤，涉及很多分子表达的改变［8-11］。这些分子主要与肿瘤转移及分子黏附相关。研究［10］显示，敲除黏附分子plakoglobin，显著降低了乳腺癌的侵袭能力。此外，C末端结合蛋白2（CtBP2）也被认为与乳腺癌的迁移有关［10-11］。研究［1-3］显示，MTA1在多种实体肿瘤中呈高表达，并且与肿瘤的转移和侵袭有关。结构上MTA2与MTA1类似，因此也被广泛研究。MTA2首先被发现在宫颈癌中高表达［4］。此后，MTA2相继被发现在卵巢上皮癌、肝细胞肝癌、非小细胞肺癌存在异常表达，且与肿瘤的浸润性表型相关，如肿瘤更大、预后更差以及淋巴结转移等［12-14］。但是虽然MTA2与MTA1结构类似，MTA1在乳腺癌中已被证实与肿瘤转移有关，有关于MTA2在乳腺癌中的作用却很少有报道。

本研究结果显示，MTA2特异性shRNA处理后，细胞的增殖能力明显受限，到第5天时，实验组约为阴性对照组细胞数目的一半。而进一步的Transwell实验显示，MTA2敲除后，MDA-MB-231细胞的侵袭、迁移能力也明显受抑制，说明癌细胞的生长和增殖能力均下降。裸鼠荷瘤实验显示，感染特异性干扰MTA2的RNA病毒后，瘤体较小，且肺部转移灶明显减少，这与体外实验结果一致，表明抑制MTA2后，乳腺癌的生长和转移能力受限，进一步说明MTA2有促进乳腺癌生长、转移的能力。

MTA2在肿瘤的调节机制还不清楚。研究［4］显示，MTA2是NuRD复合物的重要组成部分。其功能很可能与NuRD密切相关。研究［15］显示MTA2促进胃癌促进生长和转移，并且受转录蛋白sp1调节。因此，进一步研究MTA2促进乳腺癌转移的机制将有利于为乳腺癌转移的防治提供新的思路。

［1］ Toh Y，Nicolson G L.The role of the MTA family and their encoded proteins in human cancers：molecular functions and clinical implications［J］.Clin Exp Metastasis，2009，26（3）：215-27.

［2］ Hofer M D，Menke A，Genze F，etal.Expression ofMTA1 promotes motility and invasiveness of PANC-1 pancreatic carcinoma cells［J］.Br JCancer，2004，90（2）：455-62.

［3］ Qian H，Lu N，Xue L，et al.Reduced MTA1 expression by RNAi inhibits in vitro invasion andmigration of esophageal squamous cellcarcinoma cell line［J］.Clin Exp Metastasis，2005，22（8）：653-62.

［4］ Zhang Y，Ng H H，Erdjument-Bromage H，et al.Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation［J］.Genes Dev，1999，13（15）：1924-35.

［5］ Manavathi B，Singh K，Kumar R.MTA family of coregulators in nuclear receptor biology and pathology［J］.Nucl Recept Signal，2007，5：e010.

［6］ 张 峰，刘 晔，刘三光，等.RNA干预研究及其在肿瘤基因治疗中的应用［J］.中华实验外科杂志，2006，23（3）：381-2.

［7］ Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

［8］ Palmer T D，Ashby W J，Lewis JD，et al.Targeting tumor cellmotility to preventmetastasis［J］.Adv Drug Deliv Rev，2011，63（8）：568-81.

［9］ Valastyan S，Weinberg R A.Tumor metastasis：molecular insights and evolving paradigms［J］.Cell，2011，147（2）：275-92.

［10］Holen I，Whitworth J，Nutter F，et al.Loss of plakoglobin promotes decreased cell-cell contact，increased invasion，and breast cancer cell dissemination in vivo［J］.Breast Cancer Res，2012，14（3）：R86.

［11］Wang Y，Liu F，Mao F，et al.Interaction with cyclin H/cyclindependent kinase 7（CCNH/CDK7）stabilizes C-terminal binding protein 2（CtBP2）and promotes cancer cellmigration［J］.JBiol Chem，2013，288（13）：9028-34.

［12］Ji Y，Zhang P，Lu Y，etal.Expression ofMTA2 gene in ovarian epithelial cancer and its clinical implication［J］.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（3）：359-62.

［13］Lee H，Ryu SH，Hong S S，et al.Overexpression ofmetastasis-associated protein 2 is associated with hepatocellular carcinoma size and differentiation［J］.J Gastroenterol Hepatol，2009，24（8）：1445-50.

［14］Liu SL，Han Y，Zhang Y，et al.Expression ofmetastasis-associated protein 2（MTA2）might predict proliferation in non-small cell lung cancer［J］.Target Oncol，2012，7（2）：135-43.

［15］Zhou C，Ji J，CaiQ，etal.MTA2 promotes gastric cancer cells invasion and is transcriptionally regulated by Sp1［J］.Mol Cancer，2013，12（1）：102-6.

Inhibition of M TA2 suppresses the proliferation and m igration of MDA-MB-231 breast cancer cells

Weng Wei1，Xu Yuanhong1，Song Xiaofei2
（1Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；2Dept of Blood Transfusion，Tongling First People's Hospital，Tongling 244009）

ObjectiveTo study the expression and role ofmetastasis-associated tumor gene family 2（MTA2）in human breast cancer.MethodsThe shRNA sequence targeting human MTA2 gene was designed and chemically synthesized，then we constructed MDA-MB-231 cell lines that stably expressed the specific shRNA against MTA2，mRNA and protein levels of MTA2 were detected by quantitative Real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）and Western blot，respectively.CCK-8 and Transwell assay were performed to detect the MDA-MB-231 cell viability and metastasis in vitro，xenograftmodel was constructed to investigate cancerous cell growth and metastasis ability in vivo.ResultsKnockdown of MTA2 by lentivirus-delivered shRNA againstMTA2（Lv-shMAT2）significantly reduced mRNA and protein levels of MTA2 in MDA-MB-231 cell line（P＜0.05）.Lv-shMAT2 significantly slowed down cell proliferation and invasion.Furthermore，depletion of MAT2 significantly limited tumor growth and tumor transfer to lung in a xenograftmodel.ConclusionDepletion of MTA2 could significantly inhibit human breast cancer cell growth and metastasis，implying that MTA2 might be involved in the progression of breast cancer.

RNA interference；MTA2；breast cancer；growth；metastasis

R 737.9

A

1000-1492（2016）03-0373-05

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.028.html

2015-12-08接收

安徽省科技创新公共服务平台项目（编号：PT20081011）作者单位：1安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥 230022

2铜陵市人民医院输血科，铜陵 244009

翁 伟，男，主管检验师；

徐元宏，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：xyhong1964@163.com