一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体IME-CF2的分离、测序及全基因组分析

刘小东，王 伟，黄 勇，张湘莉兰，孙 强，安小平，米志强，童贻刚

◇基础医学研究◇

一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体IME-CF2的分离、测序及全基因组分析

刘小东1，2，王 伟2，黄 勇2，张湘莉兰2，孙 强2，安小平2，米志强2，童贻刚1，2

目的从医院污水中分离一株能裂解弗氏柠檬酸杆菌的噬菌体，观察其形态，并进行全基因组测序和全基因组分析，为治疗和控制弗氏柠檬酸杆菌感染提供基础。方法以弗氏柠檬酸杆菌为宿主，从医院污水分离噬菌体，用透射电镜观察其形态；使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序，测序后进行噬菌体全基因组序列组装、注释、进化分析和比较分析。结果成功分离一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，命名为IME-CF2；电镜观察显示，该噬菌体具有二十面体的头部，形态类似肌尾噬菌体科；IME-CF2核酸类型为DNA，基因组全长为177 685 bp，GC含量为43.2%；编码267个编码区（CDS），2个tRNA；进化分析表明，IME-CF2属于T4类噬菌体，全基因组比较分析表明，IME-CF2与柠檬酸杆菌噬菌体Miller同源性最高。结论分离鉴定了一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，进行了全基因组测序和分析，为噬菌体治疗多重耐药细菌奠定了基础。

弗氏柠檬酸杆菌；噬菌体；全基因组测序；基因组分析

弗氏柠檬酸杆菌属肠杆菌科枸橼酸杆菌属，是发酵型革兰阴性菌，广泛存在于自然环境中，是人体肠道正常菌群，也是条件致病菌。近年来，随着抗生素的滥用，弗氏柠檬酸杆菌对常见的抗生素产生耐药［1］，给临床感染治疗带来极大挑战。噬菌体是一种能特异性感染细菌的病毒，广泛存在于自然环境中，毒性噬菌体能引起宿主菌裂解死亡［2］。噬菌体是一种潜在的抗生素替代品，能有效治疗细菌性感染，同时减轻细菌耐药的发生。目前，噬菌体与抗生素联合用药及多种噬菌体鸡尾酒疗法对细菌性感染的治疗效果较好［3-4］。该研究从医院污水中分离一株毒性弗氏柠檬酸杆菌噬菌体IME-CF2，并对其进行了全基因组测序、基因组分析及进化分析。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料弗氏柠檬酸杆菌分离于中国人民解放军307医院检验科，经过生化性质鉴定和16S rDNA测序鉴定，保藏于本实验室。

1.2方法

1.2.1 IME-CF2的分离与鉴定 取未经处理的解放军307医院污水，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，并通过0.45μm的滤膜。取上述过滤液0.100 ml，加入到5 ml对数期指示菌弗氏柠檬酸杆菌中，于37℃震荡过夜培养。第2天，取培养液12 000 r/min离心10 min，收集上清液，并通过0.45μm的滤器，所得过滤液即为噬菌体原液。使用噬菌体原液点滴法检测是否分离到敏感性噬菌体。在铺有指示菌的双层平板2区域滴加0.001 5 ml的噬菌体原液，1区域滴加0.001 5 ml的PBS（磷酸盐缓冲液）作为阴性对照组；观察有无噬菌斑。

将上述敏感性噬菌体原液梯度系列稀释后与对数期指示菌混匀铺板做空斑形成实验。37℃温箱孵育6 h，挑取单个噬菌斑接种到对数期的指示菌中；37℃震荡培养6 h后，再次铺双层琼脂板观察噬菌斑，重复3次挑取单个空斑过程，分离到纯种噬菌体。

1.2.2 IME-CF2电镜观察 噬菌体样品使用磷钨酸染色2 min，室温干燥后在Philips TECNAI-10型透射电子显微镜（TEM）下观察噬菌体的形态。

1.2.3 IME-CF2基因组DNA提取 参照Lu et al［5］的方法（略有改动），抽提核酸。取0.600 m l的噬菌体液（滴度约4.3×1012PFU/L），加入胰DNaseⅠ和RNase A至终浓度1 mg/L，37℃过夜处理，随后80℃灭活15 min，以使上述酶失活。然后加入0.5 mol/L EDTA（终浓度0.02 mol/L），20 g/L蛋白酶K（终浓度50 mg/L），10%SDS（终浓度0.5%），56℃水浴1 h。加入等体积酚抽提核酸，10 000 r/min离心5 min，转移上层水相到一新的1.5 ml离心管中。向上述离心管中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1），温和混匀后10 000 r/min离心5 min，以去除蛋白、糖类等物质污染。取上述离心管中水相到一个新的离心管中，并加入等体积异戊醇，-20℃下静止3 h后12 000 r/min离心25 min，收集沉淀。用75%的冰乙醇洗涤上述DNA沉淀，室温干燥后用去离子水重悬浮上述DNA沉淀。

1.2.4 IME-CF2高通量测序文库的构建与上机取0.100 mg的高质量噬菌体基因组DNA加水稀释到0.050 mg，超声打断约20 min，末端补平，两端链接接头。加入1.8倍体积的AMPure XP Beads纯化DNA，使用E-Gel胶选择长约380 bp的DNA片段。PCR扩增上述DNA片段，加入1倍体积的AMPure XP Beads纯化PCR扩增产物。随后取上述工作库进行油包水PCR反应，碱法制备单链DNA测序模板。最后将带有模板的微磁珠离心到318C芯片的微孔中，上机测序。

1.2.5 IME-CF2全基因组序列分析 IME-CF2全基因组序列组装使用Newbler v2.9（454 Life Sciences Corporation）软件。全基因组使用RAST（Rapid Annotation using Subsystem Technology）［6］和BASys（Bacterial Annotation System）在线注释。序列相似性比对分析使用BLAST在线工具及mauve v.2.3.1，使用MEGA5.0建立进化树。使用DNAPlot1.11绘制基因组圈图。

2 结果

2.1IME-CF2的形态弗氏柠檬酸杆菌888分离于解放军307医院患者血液，抗生素耐药性见表1。以上述弗氏柠檬酸杆菌888作指示菌，成功从污水中分离到一株毒性弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，命名为IME-CF2。IME-CF2能在铺有指示菌的双层平板上2区形成透亮的圆形噬菌环，而点有PBS的对照区1区无明显变化，见图1A。IME-CF2能形成直径约1 mm清晰透亮的噬菌斑，见图1B。电镜照片表明该噬菌体具有典型的二十面体结构和以收缩的尾部，头部直径约0.080μm，尾部长约0.120μm，归属于肌尾噬菌体科，见图2。根据国际委员会关于噬菌体命名的方法，该噬菌体可命名为vB_CFRMIME-CF2。

2.2IME-CF2全基因组测序和组装约0.600 ml的噬菌体液（滴度约4.3×1012PFU/L）用于基因组DNA提取，成功提取浓度为178 g/L的高质量噬菌体核酸。约0.100 mg的噬菌体基因组DNA用于构建测序文库，测序约产生694 679条平均长度287 bp的高质量测序片段（Reads），约200 543 826个碱基，测序深度高达1 129倍（200 543 826÷177 689≈1 129）。约有17 280条平均长度约266 bp的Reads用于基因组序列组装，参与组装碱基约4 606 735个，平均覆盖倍数为26（4 606 735÷177 689≈26）倍。噬菌体IME-CF2基因组组装结果产生长约177 kbp的单一contig（重叠群），随后成功环化此重叠群，即测序数据分析可知该噬菌体基因组是环状的。环化后完整基因组长度为177 685 bp。

2.3IME-CF2高通量测序（HTS）高频序列分析

噬菌体末端序列通常在其基因组复制、包装等方面有重要作用。序列分析发现，噬菌体高通量测序中高频出现的测序序列就是该噬菌体末端序列［7］。根据文献［8］建立的病毒基因组末端结构分析方法，通过把所有原始高通量测序的Reads映射到（mapping）到组装好基因组上，统计分析所有Reads的出现次数，并根据出现次数从高到底排序。大部分高通量测序Reads重复次数小于10，没有特别高频的测序Reads出现，见图3（X轴表示Reads重复次数取值范围。例如，X=10表示Reads重复次数在0到10之间的所有测序Reads总数，X=15表示Reads重复次数在10到15之间的所有测序Reads总数。Y轴表示Reads条数的统计）。高通量测序Reads的排序，见图4，只列出前20条。从该图可以看出最高频的序列大概出现20多次，没有特别高频的序列出现，符合上述统计。所以，IME-CF2没有固定的基因组末端序列，复制时开环及末端切割是随机的。

2.4IME-CF2基因组分析IME-CF2全基因组长度为177 685 bp，基因组A、C、G、T碱基含量分别为28.3%、21.8%、21.4%和28.5%，GC含量为43.2%，共有269个开放阅读框（ORFs），包括267个CDS和2个tRNA。269个ORF中大部分ORF的起始密码是ATG，约占91%。CDS核酸序列长度在117～3 360 bp，对应的蛋白质序列长度在38～1 219 aa。全部的ORF共含166 089 bp的碱基，基因组基因密度高达94%。图5为IME-CF2全基因组圈图：共6圈，由外到内依次为线性基因组长度代表、位于正链CDS、位于负链CDS、gene和tRNA、GC含量和GC偏移。由图可以看出编码区在该噬菌体正负链上长度大约相等，基因成簇分布，相似功能的基因邻近，符合T4类噬菌体基因组特征。BLASTN比对表明IME-CF2与柠檬酸杆菌噬菌体Miller（178 Kbp）的同源性最高，其次是肠道菌噬菌体RB43（179 Kbp），比对覆盖率分别为97%和92%。Miller分离于美国、RB43分离于法国，核酸序列GenBank登录号分别为KM236237和HE858210。表2为三株噬菌体碱基组成比较。图6为MAUVE v.2.3.1所作三株噬菌体之间的同源分析图，可见基因组高度同源，没有发现大的插入、缺失等突变，基因组间同源性较高。

2.5IME-CF2功能性ORF分析使用BLASTP分析，将具有推定基因功能的ORF分成4类：结构与包装模块（红色）；生物合成与代谢模块（蓝色）；裂解相关基因（黄色）；假想蛋白（灰色），见图5。

使用BLASTP对蛋白序列分析表明，ORF262（噬菌体末端酶大亚基）和ORF264（噬菌体末端酶小亚基）在噬菌体包装时起重要作用。ORF259（噬菌体口蛋白）编码的蛋白质能使细菌细胞膜形成空洞，这有利于噬菌体基因组核酸注入到受体细菌，同时该蛋白还具有链接噬菌体头部与尾部的功能。通常上述三个ORF在基因组上临近。结构蛋白ORF254（主要衣壳蛋白）1 575 bp是噬菌体主要衣壳蛋白，与包装蛋白邻近。ORF201～ORF207编码噬菌体尾部相关蛋白，ORF93～ORF100主要负责噬菌体尾部基底板，这两个基因簇在噬菌体感染、吸附宿主菌时发挥重要作用。

噬菌体DNA复制及调控相关基因主要包括：ORF159（DNA聚合酶），ORF162（DNA引物酶），ORF187（DNA拓扑异构酶），ORF251（单链DNA结合蛋白），ORF248（DNA解旋酶）和ORF184（转录调控因子）等。ORF160（噬菌体重组蛋白）与噬菌体基因组DNA整合到宿主基因组有关。

ORF50（噬菌体裂解酶）和ORF200（溶菌蛋白）是噬菌体裂解相关基因。ORF200编码穿孔蛋白，使细菌细胞膜穿孔。该噬菌体可能是通过同时表达上述两种蛋白来介导宿主细胞裂解的。

2.6IME-CF2进化分析为了分析IME-CF2与其他噬菌体之间的关系，采用噬菌体IME-CF2主要衣壳蛋白（ORF254）序列构建了进化树。ClustalW multiple alignments软件比对主要衣壳蛋白氨基酸序列，使用Neighbor-Joining建树。括号为用于比对的各噬菌体蛋白质序列登录号。（图7）。IME-CF2与柠檬酸杆菌噬菌体Miller及肠道菌噬菌体RB43处于同一分支，即IME-CF2与Miller及RB43亲缘关系最近，属T4类噬菌体，与全基因组比较分析相吻合。

3 讨论

噬菌体是细菌病毒，是自然界中最具多样性的生物之一。相对于抗生素治疗，噬菌体疗法具有其突出优势，噬菌体是自然界存在的生物，生产成本低，对细菌有高度特异性，不破坏有益菌群，一旦目标细菌被清除噬菌体也自动消失［9］。面对日益严峻的细菌耐药问题，噬菌体疗法重新获得人们的关注，展现出广阔的前景。为了解决抗生素耐药问题，美国在20世纪90年代兴起一些噬菌体研究公司［10］。由于噬菌体具有严格的宿主特异性，以及细菌在与噬菌体相互进化过程中会对噬菌体产生耐受，单一噬菌体制剂将不能满足治疗要求。噬菌体混合制剂鸡尾酒疗法及个性化噬菌体治疗方法可能是未来噬菌体治疗的研究方向之一。此外，有些噬菌体携带耐药基因甚至毒力基因，使得它们不可直接用于治疗［11］。因此，对噬菌体进行分离、鉴定、全基因组测序及基因组学分析显得十分重要，不仅能够获得该噬菌体全面清晰的遗传信息及进化信息而且能为噬菌体治疗奠定理论基础。

综上所述，本实验利用分离于307医院检验科的耐药弗氏柠檬酸杆菌作指示菌，成功从医院污水中分离一株毒性噬菌体，命名为IME-CF2。该噬菌体可在铺有指示菌的双层平板上形成清晰透亮的噬菌斑，预示着IME-CF2是一株毒性弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，在预防和治疗弗氏柠檬酸杆菌感染方面具有潜在应用价值。电镜下IME-CF2具有典型的二十面体结构及可收缩的尾部，具有典型的肌尾噬菌体科噬菌体形态。基因组学分析表明，IME-CF2与Miller及RB43相似，功能相关基因成簇分布，具有典型的T4类噬菌体基因结构，同时进化分析表明三者聚类到同一分支。综合以上分析，可以确定噬菌体IME-CF2属双链DNA噬菌体下有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科的T4类噬菌体。噬菌体IME-CF2生物学活性实验与动物实验值得深入研究。

（噬菌体IME-CF2全基因组核酸序列GenBank登录号：KR869820）

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Isolation，sequencing and comp lete genome sequence analysis of bacteriophage IME-CF2 infecting Citrobacter freundii

Liu Xiaodong1，2，WangWei2，Huang Yong2，et al
（1AnhuiMedical University，Hefei 230032；2State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology，Beijing 100071）

ObjectiveTo isolate a lytic bacteriophage against Citrobacter freundii from hospital sewage，study its morphology and analyze its genome so as to provide basis for treatment and infection control of antibiotics-resistant Citrobacter freundii.MethodsA bacteriophagewas isolated from hospital sewage using Citrobacter freundii as host cell.Phagemorphology was observed using a transmission electronmicroscope and its genomewas sequenced using Ion Torrent sequencing platform.Genome annotation，comparative and evolutionary analysis were performed after the complete genome sequence was assembled.ResultsA lytic bacteriophage designed as IME-CF2 was successfully isolated against Citrobacter freundii.Transmission electronmicroscopy analysis indicated that the isolated bacteriophage IME-CF2 had an icosahedral head and displayedmorphology resembling Myoviridae family.The complete genome of IME-CF2 was 177 685 bp circular dsDNA and had a G+C content of 43.2%.The genome encodes 2 putative tRNA and 267 coding sequences（CDSs）.Phylogenetic analysis demonstrated that IME-CF2 belonged to T4-like virus and comparative analysis showed that IME-CF2 has the highest homology with previously reported Citrobacter phage Miller.ConclusionIsolation and characterization of a lytic Citrobacter phage，lay a foundation of the treatment ofmultiple drug resistant bacteria in the future.

Citrobacter freundii；bacteriophage；whole genome sequencing；genomic analysis

Q 939.48

A

1000-1492（2016）03-0315-05

时间：2016/1/28 14：23：09 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.002.html

2016-01-08接收

国家高技术研究发展计划（863计划）（编号：2012AA022003、2014AA021402）；国家科技重大专项课题（编号：2013ZX10004605、2013ZX10004217-002-003）

1安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所，合肥 230032

2军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

刘小东，男，硕士研究生；

童贻刚，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：tong62035@gmail.com