高浓度葡萄糖对肺腺癌A549细胞生长及VEGF、MMP-2表达的影响

李晓峰，束 军，程 宇，徐 胜，沈继龙

高浓度葡萄糖对肺腺癌A549细胞生长及VEGF、MMP-2表达的影响

李晓峰1，束 军1，程 宇1，徐 胜1，沈继龙2

目的观察高浓度葡萄糖对肺腺癌A549细胞生长及血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响。方法根据处理条件不同，将A549细胞分为：对照组（无干预）、甘露醇组（25 mmol/L甘露醇）、葡萄糖组（10、20、30、40 mmol/L葡萄糖）、顺铂组（5、10、20、40μmol/ L顺铂）和联合组（30 mmol/L葡萄糖联合5、10、20、40 μmol/L顺铂），分别处理48 h后，采用MTT法检测细胞的增殖率，比较不同组别间细胞增殖率的差异；对照组、葡萄糖组、甘露醇组处理24 h和48 h后，采用半定量RT-PCR法检测细胞中VEGF、MMP-2的mRNA水平，采用ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF、MMP-2的蛋白浓度，比较不同组别间VEGF、MMP-2的表达水平差异。结果除10 mmol/L葡萄糖组外，葡萄糖组的细胞增殖率均高于对照组（P＜0.05）；相同顺铂浓度下，联合组的细胞增殖率高于顺铂组（P＜0.05）；与对照组比较，葡萄糖组VEGF、MMP-2表达明显增强（P＜0.05），且对葡萄糖浓度有一定依赖性，葡萄糖浓度为30 mmol/L时VEGFmRNA、MMP-2的mRNA和蛋白水平达最高值，40mmol/L时VEGF蛋白浓度最高；相同干预条件，48 h细胞的VEGF、MMP-2表达水平高于24 h（P＜0.05）。结论高浓度葡萄糖能促进肺腺癌A549细胞的增殖，增强对顺铂的耐受力及VEGF、MMP-2的表达。

葡萄糖；肺腺癌；生长；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶-2

肺癌是对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，在全球和我国肺癌的发病率与死亡率都居所有恶性肿瘤之首。研究［1］提示糖尿病能增加肺癌的发生率，尤其在女性糖尿病患者中更为明显。与空腹血糖正常的肺癌患者比较，空腹血糖浓度大于126 mg/dl的肺癌患者具有更高的死亡率［2］。色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）作为血管增生的抑制因子，不仅能抑制肿瘤新生血管的形成，还能降低肿瘤细胞的增殖和转移能力［3］。课题组前期研究［4］表明，高浓度的葡萄糖能够降低肺癌细胞中PEDF的表达。高浓度葡萄糖是否对肺癌细胞的增殖、耐药及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达有影响，尚未见报道。该实验拟在体外条件下通过不同浓度葡萄糖对肺腺癌A549细胞进行干预，观察细胞的增殖情况和VEGF、MMP-2的表达水平，并且联用顺铂对细胞进行处理，比较细胞增殖率的变化。

1 材料与方法

1.1 材料A549细胞株由安徽医科大学基础医学院病理生理教研室惠赠；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；低糖DMEM培养基购自美国Hy-Clone公司；胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司；DMSO、MTT、葡萄糖、甘露醇购自美国Sigma公司；顺铂购自齐鲁制药有限公司；ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；RNA isolater、RTPCR第一链cDNA合成试剂盒和2×Taq Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成；细胞培养箱购自美国Thermo公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；酶标仪购自美国Bio-Tek公司；超速低温离心机购自美国Scilogex公司；165-4000IEF电泳仪购自美国Bio-Rad公司；DNA Marker（DL 2 000）购自日本TaKaRa公司；D-801凝胶成像分析系统购自江苏捷达科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基（含5.6 mmol/L葡萄糖）于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养A549细胞。

1.2.2MTT法检测葡萄糖及顺铂对A549细胞增殖的影响 实验分为对照组、甘露醇组、葡萄糖组、顺铂组和联合组。取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化后900 r/min离心5min，弃上清液，加培养液混匀。以6 000个/孔的密度接种于96孔板中，使每孔体积为200μl，边缘孔加200μl的PBS溶液，并留4孔（只加培养基）作为空白组，以排除系统误差，培养箱中培养。细胞贴壁后，分别加入不同含量的葡萄糖，使葡萄糖组中葡萄糖终浓度分别为10、20、30、40 mmol/L；分别加入不同含量的顺铂，使顺铂组中顺铂终浓度分别为5、10、20、40μmol/L；加入适量的葡萄糖和顺铂，使联合组中葡萄糖终浓度均为30 mmol/L，顺铂终浓度分别为5、10、20、40μmol/ L；另设对照组（无干预）和甘露醇组（甘露醇浓度为25 mmol/L）。加药完毕后，于培养箱中培养48 h。然后，每孔加入20μl MTT溶液，继续培养4 h，弃去孔内液体，每孔加入150μl DMSO，培养箱中孵育15 min。最后，用酶标仪于570 nm波长处检测各孔的吸光度（absorbance，A）值。以对照组细胞增殖率为100%，则干预组细胞增殖率（%）=（干预组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）。每次实验设置6个复孔，重复3次。

1.2.3细胞总RNA的提取及RT-PCR法检测细胞中VEGF和MMP-2的mRNA水平 取对数期细胞，以3×105个/孔的密度种于6孔板中，细胞贴壁后，分别加入不同含量的葡萄糖，使各孔的葡萄糖终浓度分别为10、20、30、40 mmol/L，另设对照组（无干预）和甘露醇组（甘露醇浓度为25 mmol/L），加药完毕后，于培养箱中培养24 h和48 h。用PBS洗细胞2遍，每孔加入1 ml RNA isolater，按照说明书提取总RNA，溶解于DEPC处理水后，-80℃长期保存。按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，-20℃保存。VEGF上游引物序列：5′-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3′，下游引物序列：5′-CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC-3′，541、408 bp［5］；MMP-2上游引物序列：5′-CCTGTTTGTGCTGAAGGACA-3′，下游引物序列：5′-GTACTTGCCATCCTTCTCAA-3′，616 bp［6］；β-actin上游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，285 bp。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃彻底延伸7 min，28个循环。用含1%琼脂糖的凝胶对PCR产物进行电泳分离，并用凝胶成像分析系统进行处理，以β-actin为内参，半定量计算VEGF和MMP-2的mRNA水平。

1.2.4ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中VEGF和MMP-2的蛋白浓度 取对数期细胞，以3 ×105个/孔的密度种于6孔板中，细胞贴壁后，分别加入不同含量的葡萄糖，使各孔的葡萄糖终浓度分别为10、20、30、40 mmol/L，另设对照组（无干预）和甘露醇组（甘露醇浓度为25 mmol/L），加药完毕后，于培养箱中培养24 h和48 h。收集细胞上清液3 000 r/min离心15 min，小心吸取上清液，分装后冻存于-80℃。按照试剂盒说明书操作，检测上清液中VEGF和MMP-2的蛋白浓度。

1.3 统计学处理采用SPSS17.0软件进行分析，计量资料以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（SNK检验进行两两比较），两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 高浓度葡萄糖能提高A549细胞增殖力及对顺铂的耐受力对照组的细胞增殖率为100%，葡萄糖组的细胞增殖率分别为（105.68±7.45）%、（115.28±5.79）%、（134.57±7.17）%、（129.71± 11.37）%，甘露醇组的细胞增殖率为（101.95+ 4.30）%，6组间细胞增殖率不完全相等（F= 60.170，P＜0.05），与对照组比较，20、30、40 mmol/ L葡萄糖组的细胞增殖率明显升高（P＜0.05），30、40 mmol/L葡萄糖组较20 mmol/L组明显升高（P＜0.05），30、40 mmol/L葡萄糖组间差别无统计学意义，见图1。顺铂组的细胞增殖率均低于对照组，且随着顺铂浓度的增大，细胞增殖率逐渐降低，各组间差别均有统计学意义（F=326.78，P＜0.05），相同浓度顺铂干预下，联合组的细胞增殖率均高于顺铂组（P＜0.05），见图2。

2.2 高浓度葡萄糖能提高A549细胞中VEGF、MMP-2的mRNA水平与对照组比较，高浓度葡萄糖干预细胞24 h和48 h后，细胞中VEGF、MMP-2的mRNA水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。相同时间点，随着葡萄糖浓度的升高，VEGF、MMP-2的mRNA水平呈逐渐升高的趋势（VEGF：F24h=71.401，F48h=58.091，P＜0.05；MMP-2：F24h=31.647，F48h=46.225，P＜0.05），在30 mmol/L葡萄糖干预时达到最高值，而后有所下降；与对照组比较，甘露醇组MMP-2的表达未见明显变化，甘露醇组VEGF的表达明显增强（P＜0.05）；相同干预条件下，与24 h比较，48 h两mRNA的水平明显升高（P＜0.05），见图3、4。

2.3 高浓度葡萄糖能提高A549细胞上清液中VEGF、MMP-2的蛋白浓度与对照组比较，高浓度葡萄糖处理细胞24 h和48 h后，细胞上清液中VEGF、MMP-2的蛋白浓度明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。相同时间点，随着葡萄糖浓度的升高，细胞上清液中VEGF的蛋白浓度逐渐升高（F24h=201.370，F48h=162.531，P＜0.05），在40 mmol/L葡萄糖干预时达最高水平；甘露醇组VEGF浓度高于对照组（P＜0.05）；相同浓度葡萄糖干预细胞，48 h上清液中VEGF浓度明显高于24 h（P＜0.05），见表1。相同时间点，随着葡萄糖浓度的升高，MMP-2的蛋白浓度逐渐升高（F24h=35.226，F48h=41.301，P＜0.05），在30 mmol/L葡萄糖干预时达到最高值，40 mmol/L葡萄糖时有所下降；与对照组比较，甘露醇组MMP-2浓度无明显变化；相同浓度葡萄糖干预细胞，48 h上清液中MMP-2浓度明显高于24 h（P＜0.05），见表2。

3 讨论

葡萄糖作为人体最基本的供能物质，在生命活动中发挥着重要的作用，然而，近来研究［7-10］显示高浓度的葡萄糖对肿瘤的发生和进展有一定的促进作用。Zhao et al［7］对胃癌患者进行研究，发现合并糖尿病者，更容易出现耐药，且预后较差，进一步，对胃癌细胞进行不同浓度的葡萄糖处理，发现高浓度的葡萄糖能促进细胞增殖，并能减弱5-氟尿嘧啶的抑制作用。对子宫内膜癌细胞分别进行含1、5、25 mmol/L葡萄糖的培养基培养发现，与5 mmol/L葡萄糖比较，1 mmol/L葡萄糖能使细胞阻滞于G1期，降低细胞的增殖能力，而25 mmol/L葡萄糖可激活AMPK/mTOR/S6和MAPK信号通路，提高细胞的增殖和侵袭能力［8］。此外，高浓度的葡萄糖还能激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进肿瘤的发生［9］。Inal et al［10］对442例进展期肺癌患者进行回顾性研究发现，在接受以铂类为基础的化疗药物的肺癌患者中，与未患糖尿病者比较，合并有糖尿病的患者具有较短的无进展生存期和总生存期。

MMP-2作为基质金属蛋白酶家族的重要成员，参与细胞外基质的分解，并能增强肺癌细胞的转移能力［11］，VEGF是最关键的促血管生长因子之一，不仅调控正常组织的血管生成，还能促进肺癌组织新生血管的形成［12］，因此VEGF和MMP-2的表达与肺癌的发生和进展有密切的关联。药物治疗，尤其是以铂类为基础的化疗药物，是中晚期肺癌患者的主要选择，但是，癌细胞的耐药现象却严重影响化疗效果，使肺癌的治疗变得困难。

本研究采用较为常见的肺腺癌A549细胞为实验对象，分别进行不同浓度的葡萄糖和25 mmol/L甘露醇进行干预，结果提示，高浓度的葡萄糖能促进A549细胞的增殖，提高VEGF、MMP-2的表达水平。随着葡萄糖浓度的提高，葡萄糖对VEGF、MMP-2表达的影响更加明显，超过一定浓度后作用反而减弱。研究［13］显示，高浓度葡萄糖作用A549细胞后，能促进活性氧的生成，激活TGF-β1/PI3K/Akt信号通路，从而提高血红素氧合酶-1的水平，最终增强转移相关蛋白MMP-9的表达及细胞的侵袭能力。由于MMP-2和MMP-9同属基质金属蛋白酶家族，具有相似的结构和功能，都参与肿瘤的转移，本研究结果与研究［13］一致，均证明高浓度葡萄糖与肺腺癌的转移有关。VEGF作为重要的促血管生成因子，与PEDF作用相反，本研究结果提示高浓度葡萄糖能提高A549细胞中VEGF水平，前期研究［4］显示高浓度葡萄糖能降低A549细胞中PEDF水平，两次研究中高浓度葡萄糖对A549细胞的作用一致。Seebacher et al［14］发现高浓度葡萄糖能通过P-糖蛋白提高A549细胞对抗肿瘤药阿霉素的抵抗力，本研究亦显示30 mmol/L的葡萄糖能提高肺癌细胞对化疗药物顺铂的耐受力，推测高浓度葡萄糖可能与A549多重耐药有关。实验中，25 mmol/L的甘露醇能一定程度地提高A549细胞中VEGF的转录和翻译水平，考虑VEGF的表达不仅与葡萄糖的浓度有关，还可能受渗透压变化的影响［15］。

综上所述，高浓度的葡萄糖能提高肺腺癌A549细胞的增殖力、对顺铂的耐受力及VEGF、MMP-2的表达。

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Effects of high glucose on the grow th and VEGF and MMP-2 expression of lung adenocarcinoma A549 cells

Li Xiaofeng，Shu Jun，Cheng Yu，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Fourth Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe effects of high glucose on the growth and expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and matrixmetalloproteinase-2（MMP-2）of lung adenocarcinoma A549 cells.MethodsAccording to the intervening factors，A549 cells were grouped as follows：control group（no intervention），mannitol group（25 mmol/Lmannitol），glucose groups（10，20，30，40 mmol/L glucose），cisplatin groups（5，10，20，40 μmol/L cisplatin），and combination groups（30 mmol/L glucosewith 5，10，20，40μmol/L cisplatin）.Cell proliferation rates of different groupswere evaluated by MTT assay after 48 hours′intervention.For the control group，glucose groups and mannitol group，levels of VEGF and MMP-2 mRNA were examined by semi-quantitative RTPCR and concentrations of VEGF and MMP-2 protein in supernatantwere determined by ELISA at24 and 48 hours after intervention，and then compared with each other.ResultsExcept for the group of 10 mmol/L glucose，glucose groups had higher proliferation rates than the control group（P＜0.05）.At the same concentration of cisplatin，combination groups had higher proliferation rates than the cisplatin groups（P＜0.05）.Compared with the control group，the expression of VEGF and MMP-2 in glucose groupswas remarkably increased in a glucose concentrationdependentmanner，with peak levels of VEGFmRNA，MMP-2mRNA and the protein ofMMP-2 at30mmol/L glucose and peak level of VEGF protein at40 mmol/L glucose.Under the same intervention，the expression of VEGF and MMP-2 was higher after intervening for 48 hours than 24 hours（P＜0.05）.ConclusionHigh glucose can promote the proliferation of A549 cells，strengthening the resistance to cisplatin and the expression of VEGF and MMP-2.

glucose；lung adenocarcinoma；growth；vascular endothelial growth factor；matrixmetalloproteinase-2

R 734.2

A

1000-1492（2016）03-0363-06

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.024.html

2016-01-08接收

安徽省自然科学基金面上项目（编号：1308085MH141）；

安徽医科大学科研基金资助项目（编号：2010xkj115）

1安徽医科大学第四附属医院呼吸内科，合肥 230022

2安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室、安徽医科大学基础医学院病原生物学教研室，合肥230032

李晓峰，男，硕士研究生；

束 军，男，医学博士，硕士生导师，责任作者，E-mail：J. Shu@126.com