双-β-咔啉衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性

郭　亮, 曹日晖, 范文玺, 甘紫云, 马　芹

(1. 石河子大学化学化工学院, 石河子 832003;2. 新疆华世丹药物研究有限责任公司, 乌鲁木齐 830011;3. 中山大学化学与化学工程学院, 广州 510275)



双-β-咔啉衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性

郭亮1,2, 曹日晖3, 范文玺2, 甘紫云2, 马芹2

(1. 石河子大学化学化工学院, 石河子 832003;2. 新疆华世丹药物研究有限责任公司, 乌鲁木齐 830011;3. 中山大学化学与化学工程学院, 广州 510275)

摘要以去氢骆驼蓬碱为原料, 经过脱甲基、 烷基化等步骤, 合成了一系列双-β-咔啉衍生物. 目标化合物均经核磁共振谱(NMR)和质谱(MS)进行结构确证. 以顺铂为阳性对照药, 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法考察了目标化合物体外抗肿瘤(Bel-7402, 786-0, BGC-823, A375, 769-P和MCF7等6株细胞)活性. 结果表明, 化合物4g和4o与阳性对照药相比具有良好的抗肿瘤活性, 其半抑制浓度(IC50)值均小于10 μmol/L. 初步构效关系研究表明, 当桥链亚甲基数目为8～10,β-咔啉环上9-丁基或9-异丁基取代时, 化合物的抗肿瘤活性较强.

关键词去氢骆驼蓬碱;β-咔啉; 抗肿瘤活性; 构效关系

双体分子抗肿瘤药物是通过桥链将2个抗肿瘤单体分子结合起来, 使药物分子与受体的亲和性及亲和力显著提高, 从而提高药物的抗肿瘤活性[1]. 近年来, 随着多价态结合理论在药物研发设计中的广泛应用, 国内外对双体分子药物的研究逐渐增多. 结合药物分子根据受体与药物之间的配位关系, 目前已设计合成了二聚、 寡聚及多聚抑制剂[2]. 骆驼蓬(PeganumharmalaL.)为一种蒺藜科多年生草本植物, 是蒙古族和维吾尔族的习用药材, 已被列入卫生部维吾尔药药品标准[3]. 去氢骆驼蓬碱(Harmine)是骆驼蓬的主要化学成分, 该生物碱具有抗肿瘤[4～6]、 抗阿尔茨海默病[7]、 抗病毒[8～10]、 抗炎[11～13]、 抗菌[14]及杀虫[15]等多方面的药理作用, 但因其具有神经毒性而未能开发成药物.

我们[6,16～18]曾合成了一系列去氢骆驼蓬碱衍生物, 初步获得了该类化合物抗肿瘤的构效关系, 发现7-甲氧基取代为该类化合物的神经毒性位点; 并根据双体分子多价态结合理论设计、 合成了一系列两分子1-甲基-β-咔啉通过连接基连在一起的化合物, 通过生物活性测试发现当桥链亚甲基数目为4时(B-9-3, 结构见图1), 该类化合物对人肺癌、 乳房癌和结肠癌细胞表现出高抑制活性, 而且该化合物可以抑制人脐静脉内皮细胞株中微管的形成[19,20]. Sandler等[21]从深水海绵(Plakortisnigra)中分离出β-咔啉二聚体(Plakortamines C, 结构见图1), 其对HCT-116人体结肠癌细胞株表现出抑制活性. 朱华结等[22]对该类化合物的立体结构进行了研究.

基于前期工作[6,16～18], 本文以去氢骆驼蓬碱为中心结构, 首先对神经毒性位点进行结构修饰, 再进行二聚体化合物的合成, 共得到了19个具有新颖结构的7-双-β-咔啉衍生物, 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法考察了其在细胞水平的抗肿瘤活性.

1实验部分

1.1试剂与仪器

碘甲烷、 碘乙烷、 碘代正丁烷、 碘代正己烷、 碘代正辛烷、 碘代异丁烷、 1-溴-3-苯基丙烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和氢化钠(NaH)均为市售分析纯或化学纯试剂; 1,3-二溴丙烷、 1,4-二溴丁烷和1,5-二溴戊烷等二溴烷烃均购自百灵威试剂公司; 去氢骆驼蓬碱(含量>98%), 由本课题组提取获得.

Varian Saturan 2000型质谱仪(美国瓦里安技术中国有限公司); Varian inova-400型核磁共振仪(CDCl3或CD2Cl2为溶剂, TMS为内标, 美国瓦里安技术中国有限公司); Model 680型酶标仪(美国伯乐生命医学产品有限公司); WRS-3型熔点测定仪(上海仪电物理光学仪器有限公司); 薄层色谱用硅胶G(台州市路桥四甲生化塑料品厂); 柱色谱用硅胶(200～300目, 青岛海洋化工有限公司).

1.2目标化合物的合成

目标化合物的合成路线见Scheme 1.

1.2.1中间体2a～2g和3a～3g的合成中间体2a～2g参考文献[6]方法合成, 中间体3a～3g参考文献[23]方法合成. 产物2a～2g和3a～3g均为白色固体, 其中化合物2d, 2e, 3a, 3d和3e为新化合物, 各中间体的表征结果分别列于表1和表2.

1.2.2双-β-咔啉化合物(4a～4s)的合成将1,9-二甲基-7-羟基-β-咔啉(6 mmol, 1.27 g)、 DMF

(30 mL)、 NaH(8 mmol, 0.32 g)和二卤代烷烃(3 mmol, 360 μL)混合, 常温下搅拌反应4 h后, 再升温至80 ℃反应8～24 h, 用薄层色谱(TLC)监测反应进程[展开剂:V(丙酮)∶V(石油醚)=1∶1]. 反应完毕, 将反应混合物倒入100 mL水中, 常温下搅拌2 h后, 用乙酸乙酯萃取, 合并萃取液, 再依次用水和饱和盐水洗涤, 用无水硫酸钠干燥, 减压浓缩至干, 用硅胶柱层析[V(丙酮)∶V(石油醚)=1∶1], 得到目标化合物4a～4s. 目标化合物的理化性质数据列于表3, 核磁共振波谱数据列于表4.

Continued

Continued

a. CDCl3(4a—4o), CD2Cl2(4p—4s);b. CDCl3(4a—4o), CD2Cl2(4p—4s).

1.3体外抗肿瘤活性测试

以HepG2, HT-29, Blu-87, 22RV1, 786-0和MCF-7细胞为对象, 采用MTT法[24]测试了目标化合物4a～4s对癌细胞的抑制活性. 分别将生长状态良好, 处于对数生长期的细胞株以1×104个/mL的浓度接种于96孔板中, 置于37 ℃的CO2培养箱中培养24 h, 更换新鲜培养液, 加入灭菌处理的待测化合物, 继续培养48 h后, 弃去培养液, 每孔加20 μL含5 mg/mL MTT的RPMI1640培养液, 继续培养4 h, 除去上层清液后, 每孔加入100 μL DMSO, 振荡约10 min溶解沉淀, 采用酶标仪检测OD值(波长为490 nm), 采用作图法计算每个样品的IC50值.

2结果与讨论

2.1化合物的合成

根据前文[6,16～18]的构效关系分析,β-咔啉环9-位取代有助于提高该类化合物的抗肿瘤活性, 因此在DMF溶液中, 存在NaH的条件下与相应的烷基化试剂完成N9-烷基化反应. 进一步对7-位进行脱甲基反应, 主要去除化合物神经毒性, 然后与相应的二卤代烷烃反应获得目标化合物. 该反应过程中采用了2种碱性体系(DMF/NaH和DMF/K2CO3), 从反应时间、 收率及后处理的难易等方面对2种体系进行了考察, 发现在DMF/NaH体系中反应速率明显比DMF/K2CO3体系的快, 而且DMF/K2CO3体系因反应比较慢导致原料反应不完全, 后处理较复杂, 产率较低. 当β-咔啉环9-位无取代基时,N9-H原子显酸性, 在DMF/NaH体系中, 因NaH碱性较强, 会脱去N上的H, 导致N9-烷基化反应; 而DMF/K2CO3体系由于碱性弱, 只能脱去β-咔啉环羟基的H, 而不能脱去N上的H, 导致O7-烷基化, 从而以较高产率获得目标产物.

2.2体外抗肿瘤活性及初步构效关系分析

以顺铂(DDP)作为阳性对照, 采用MTT法测试了目标化合物的体外抗肿瘤活性. 为提高目标化合物的水溶性, 制备成盐酸盐供实验用. 目标化合物的活性数据列于表5. 由表5可见, 化合物4c,4k和4r几乎对所有细胞株的IC50值均>100 μmol/L, 未表现出抗肿瘤活性; 而化合物4g, 4l, 4o和4s比其它化合物的活性好, 说明桥链亚甲基的数目越多对活性影响越大, 化合物的活性越好. 对比各系列化合物活性数据发现,β-咔啉环9-位取代基对该类化合物的抗肿瘤活性也有影响; 由于前期已获知9-芳基取代时, 7-脱甲基并不能获得目标产物[16], 所以该系列化合物选择9-取代基时, 只选择了烷基及芳烷基取代. 活性测试结果表明, 9-正丁基取代衍生物(4e～4g)和9-异丁基取代衍生物(4m～4o)的体外抗肿瘤活性整体优于其它系列. 其中以化合物4g和4o体外抗肿瘤作用尤其好, 其IC50值对所有细胞系均小于10 μmol/L, 活性数据优于阳性对照药顺铂. 通过对比细胞系之间的实验结果, 发现该类型化合物对HT-29和Blu-87较其它细胞系稍敏感, 整体显示出较强的抗肿瘤活性.

Continued

* Data represent the mean values of three independent determinations; NT: not tested.

3结论

以去氢骆驼蓬碱为原料, 设计合成了19个新的7-双-β-咔啉类衍生物. 目标化合物的体外抗肿瘤测试结果表明, 当桥链亚甲基的数目为8～10,β-咔啉环9-位丁基或异丁基取代时, 活性较好; 部分7-双-β-咔啉衍生物仅对1或2种肿瘤细胞系具有良好的抗肿瘤活性, 推测此类化合物可能具有较高的选择性.

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(Ed.: P, H, Y, K)

† Supported by the Xinjiang Production and Construction Corps Leadership in Scientific Innovation Program, China(No.2015BC001).

Design, Synthesis andinvitroAntitumor Activities of Novel Bivalentβ-Carbolines†

GUO Liang1,2, CAO Rihui3*, FAN Wenxi2, GAN Ziyun2, MA Qin2

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China;2.XinjiangHuashidanPharmaceuticalResearchCo.Ltd.,Urumqi830011,China;3.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China)

KeywordsHarmine;β-Carboline; Antitumor activity; Structure-activity relationship

AbstractA series of novel bivalentβ-carbolines with a spacer of three to ten methylene units between the 7-oxygen was synthesized and characterized by nuclear magnetic resonance(NMR) and mass spectrometry(MS). The antitumor activities against Bel-7402, 786-0, BGC-823, A375, 769-P and MCF7 cell linesinvitrowere investigated by MTT method. The results demonstrated that compounds 4c, 4k and 4r were almost inactive against all tumor cell lines, compounds 4g and 4o displayed significant cytotoxic activities with IC50value of lower than 10 μmol/L against all tumor cell lines. Most compounds displayed good and selective cytotoxic activities against HT-29 and Blu-87 cell lines. Primary structure-activity relationships(SARs) analysis indicated that the length of the spacer affected cytotoxic activitiesinvitro, and 8—10 methylene units were more favorable. Moreover,n-butyl ori-butyl substituents in position-9 ofβ-carboline facilitated the antitumor potencies.

收稿日期:2016-02-19. 网络出版日期: 2016-05-18.

基金项目:新疆生产建设兵团中青年科技创新领军人才计划项目(批准号: 2015BC001)资助.

中图分类号O626

文献标志码A

联系人简介: 曹日晖, 男, 博士, 副教授, 主要从事抗肿瘤新药构效关系研究. E-mail: caorihui@sysn.edu.cn