甘露聚糖肽的结构鉴定

沈艳红, 陈林枭, 张文清, 徐志珍, 宛燕飞, 张　力, 夏　玮

(1. 华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室, 上海 200237;2. 成都利尔药业有限公司, 成都 610083)



甘露聚糖肽的结构鉴定

沈艳红1, 陈林枭1, 张文清1, 徐志珍1, 宛燕飞2, 张力2, 夏玮1

(1. 华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室, 上海 200237;2. 成都利尔药业有限公司, 成都 610083)

摘要采用离子交换柱层析和凝胶柱层析从甘露聚糖肽原料中分离纯化得到4种均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B; 通过单糖组成分析、 甲基化分析、 氢核磁共振谱(1H NMR)、 红外光谱(IR)和氨基酸组成分析等手段对均一糖肽MT1-A, MT1-B和MT2-B的结构进行了鉴定. 结果表明, 3种均一糖肽的单糖组成、 糖残基的连接方式与MT2-A相同, 但是分子量以及氨基酸总量有所不同. 测定了不同批次甘露聚糖肽原料的1H NMR谱, 以MT2-A的1H NMR谱图为标准谱, 以异头氢区域为鉴定区域, 通过计算不同批次甘露聚糖肽原料以及其它3种均一糖肽与MT2-A的1H NMR谱的相关系数, 定量评价了不同批次甘露聚糖肽原料与4种均一糖肽的相似程度. 结果表明, 甘露聚糖肽是由糖链结构一致、 分子量和氨基酸含量不同的几种均一糖肽构成的混合物.

关键词甘露聚糖肽; 多糖; 结构

甘露聚糖肽是中国首创的一种新型免疫促进剂, 原名多抗甲素(Polyactin A, PAA)[1], 是由健康人咽喉部分离的α-溶血性链球菌33号菌株经深层培养、 发酵提取而得到的一种糖肽类物质, 临床上被广泛用于恶性肿瘤的辅助治疗[2～4]、 皮肤疾病[5,6]和呼吸道反复感染[7,8]等领域.

近年来, 对甘露聚糖肽的研究多集中于生物活性、 作用机制及临床应用等方面[9～12], 对其结构研究较少, 主要成分结构仍不完全明确. 邹敬源等[13]从多抗甲素中提取了一种川链多糖, 并对其结构进行了初步研究. 本课题组[14]从甘露聚糖肽原料(批号: G100102, 091202, 140401, 140501)中分离纯化得到4个均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B, 并对其中主要成分MT2-A的精细结构进行了研究. 结果表明, MT2-A的多糖部分主链由1,6-连接的甘露糖残基构成, 分支点位于1,2,6-连接的甘露糖残基的O-2位, 支链由1,2-, 1,3-和末端连接的甘露糖残基构成; 此外, MT2-A中含有16种氨基酸, 氨基酸总量为4.41%. 本文在此基础上, 通过单糖组成分析、 甲基化分析、 氢核磁共振谱(1H NMR)、 红外光谱(IR)和氨基酸组成分析等手段对均一糖肽MT1-A, MT1-B和MT2-B的结构进行鉴定, 并测定了4种均一糖肽的免疫活性, 为甘露聚糖肽活性成分的确定、 生物活性与构效关系的研究以及甘露聚糖质量标准的完善提供了理论基础.

1实验部分

1.1试剂与仪器

甘露聚糖肽原料由成都利尔药业有限公司提供(批号: G100102, 091202, 140401, 140501); DEAE-纤维素购自Whatman公司; Sephacryl S-300葡聚糖凝胶介质购自国药集团化学试剂有限公司; 葡聚糖(Mw=12000, 50000, 270000, 670000)购自Fluka公司; 甘露糖、 葡萄糖、 半乳糖醛酸、 半乳糖、 鼠李糖、 木糖和阿拉伯糖等单糖标准品购自上海源聚生物科技有限公司; 其它试剂均为国产分析纯.

DD2-400-MR型核磁共振仪(安捷伦科技有限公司); Nicolet Magna-IR550型红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技公司); Agilent 1100型高效液相色谱仪和Agilent 6890/5975型气相色谱-质谱联用仪(安捷伦科技有限公司); Biochrom30+型全自动氨基酸分析仪(英国Biochrom公司).

1.2实验过程

1.2.1甘露聚糖肽的分离纯化及分子量测定采用DEAE-纤维素离子交换柱(50 cm×2.6 cm)分离甘露聚糖肽, 分别以水和NaCl溶液(0.1 mol/L)为洗脱液, 流速2 mL/min, 水洗脱部分所得产物命名为MT1, NaCl溶液洗脱部分所得产物命名为MT2.

对MT1和MT2分别采用Sephacryl S-300凝胶层析柱(80 cm×1.6 cm)纯化得到4种均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B.

采用高效凝胶过滤色谱法测定甘露聚糖肽的分子量及分布[15,16], 以不同分子量的葡聚糖(Mw=12000, 50000, 270000和670000)为标准品. 根据样品的峰型判断其纯度, 用Agilent GPC软件计算样品分子量及其分布.

1.2.2单糖组成分析参照文献[17,18]方法, 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色谱法测定单糖组成.

1.2.3甲基化分析采用Needs方法[19,20]对多糖样品进行甲基化, 用IR检测, 在确认完全甲基化后, 将多糖水解、 还原及乙酰化, 进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析. GC-MS分析条件: HP-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 程序升温: 120 ℃保持2 min, 以5 ℃/min的速率升温至250 ℃, 保持10 min; 分流比3∶1; 进样量1 μL, 进样口温度250 ℃, 质谱离子源温度180 ℃; 接口温度200 ℃, 离子源电压70 eV.

1.2.4红外光谱分析取甘露聚糖肽样品1～2 mg, 用溴化钾压片后, 进行红外光谱测定.

1.2.5核磁共振氢谱分析取10 mg样品溶于0.5 mL重水中, 进行1H NMR谱分析. 采用相关系数法测定谱图的相似度, 将特征鉴别区谱图峰型和峰位移值与均一糖肽MT2-A谱图进行对比, 计算相关系数ρ. 如果相关系数ρ>0.95, 认为二者糖链结构一致; 反之, 则认为是糖链结构不一致.

1.2.6氨基酸组成分析称取500 mg甘露聚糖肽样品, 用10 mL盐酸(6 mol/L)在充氮气状态下于110 ℃水解22 h后, 测定氨基酸组成, 检测波长为570和440 nm.

1.2.7免疫原性测定取一定量样品和甘露聚糖肽对照品, 分别加入氯化钠注射液制成浓度为10 mg/mL的溶液, 再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128和1∶256(稀释度积比)的稀释液作为样品溶液和对照品溶液. 取甘露聚糖肽对照品溶液及样品溶液各0.1 mL置于试管中, 加入0.1 mL 2单位抗体及0.2 mL 2单位补体, 摇匀, 于4～8 ℃放置4 h以上, 于37 ℃下保温30 min, 加入0.2 mL致敏羊血红细胞, 摇匀, 于37 ℃下保温30 min, 观察各管溶血情况. 同时设抗原(不加抗体, 以0.1 mL磷酸盐缓冲液代替)、 抗体(不加抗原, 以0.1 mL磷酸盐缓冲液代替)、 补体(不加抗原、 抗体, 以0.2 mL磷酸盐缓冲液代替)对照管, 以上3种对照管应全溶血; 另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、 抗体和补体, 以0.4 mL磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血. 样品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的1倍以上.

2结果与讨论

2.1MT1-A, MT1-B和MT2-B的分子量及分布

采用DEAE-纤维素离子交换层析柱和Sephacryl S-300凝胶层析柱对发酵得到的甘露聚糖肽原料进行分离纯化, 得到4种均一糖肽MT1-A, MT1-B, MT2-A和MT2-B. 采用高效凝胶过滤色谱法测定了MT1-A, MT1-B和MT2-B的分子量及分布(图S1, 见本文支持信息). 采用GPC软件计算得出MT1-A, MT1-B和MT2-B的重均分子量Mw分别为5.69×104, 1.55×104和3.28×104; 数均分子量Mn分别为3.77×104, 1.05×104和1.91×104. 上述3个均一糖肽的重均分子量及数均分子量均小于MT2-A[14].

2.2MT1-A, MT1-B和MT2-B的单糖组成

MT1-A, MT1-B及MT2-B经三氟醋酸(TFA)水解, PMP衍生化后进行高效液相色谱分析, 色谱图见图S2(见本文支持信息). 通过与相应标准单糖衍生物的保留时间进行比较发现, MT1-A, MT1-B和MT2-B的单糖组成均为甘露糖和葡萄糖, 其中绝大部分为甘露糖, 极少量为葡萄糖. 3种均一糖肽的单糖组成与MT2-A很相似.

2.3MT1-A, MT1-B和MT2-B的甲基化分析

MT1-A, MT1-B和MT2-B的甲基化分析结果与MT2-A几乎完全相同, 甘露糖残基均主要有1-, 1,2-, 1,3-, 1,6-和1,2,6-几种连接方式; 葡萄糖因含量低, 葡萄糖残基连接方式均未检出.

2.4MT1-A, MT1-B和MT2-B的红外光谱分析

由MT1-A, MT1-B和MT2-B的红外光谱(图S3, 见本文支持信息)可见, 3种均一糖肽的红外光谱与MT2-A几乎一致, 谱图中显示出多糖的典型吸收特征峰, 其中3422 cm-1处为O—H伸缩振动引起的强吸收峰, 2924 cm-1处的吸收峰为C—H的伸缩振动吸收峰; 1644 cm-1处的为糖结晶水的吸收峰; 1132和1059 cm-1处的吸收峰为C—O伸缩振动峰; 812 cm-1处的吸收峰为甘露糖残基的特征吸收峰.

2.5MT1-A, MT1-B和MT2-B的1H NMR谱分析

由MT1-A, MT1-B和MT2-B的1H NMR谱(图S4, 见本文支持信息)可见, 3种均一糖肽的1H NMR谱峰型及谱峰化学位移值与MT2-A几乎完全一致. 谱图信号主要集中在δ3.20～5.80之间, 分为异头氢区(5.80～4.40)和环质子区(4.40～3.20) 2个区域. 根据文献[14]对MT2-A的鉴定结果,δ5.29, 5.14, 5.12和5.08, 5.04, 4.90分别归属为1,2-, 1,3-, 1,2,6-, 末端和1,6-连接甘露糖残基的异头氢信号.

2.6MT1-A, MT1-B和MT2-B的氨基酸组成分析

将3种均一糖肽用盐酸水解后, 测定其氨基酸种类及含量, 结果列于表1. 由表1可知, MT1-A, MT1-B和MT2-B中均含有16种氨基酸, 氨基酸总量分别为3.88%, 6.15%和9.11%.与MT2-A相比, MT1-A, MT1-B和MT2-B所含氨基酸种类相同, 但氨基酸总量有所差别.

2.74种均一糖肽的免疫原活性

补体结合实验是利用竞争来实现的, 其中的反应系统(抗原与抗体)与指示系统[绵羊红细胞(SRBL)与溶血素]争夺补体系统, 即当待测的标本中有相应的目标抗原(或抗体)时, 抗原抗体发生反应后可以结合补体, 再加入指示系统(SRBL与相应溶血素), 由于体系中没有游离的补体, 不能与指示医学系统发生反应, 也不会出现溶血现象, 即阳性实验无溶血现象.

将批号为G100102的甘露聚糖肽原料以及其中分离出的4种均一糖肽与甘露聚糖肽对照品比对表明, 甘露聚糖肽原料及4种均一糖肽的最高稀释度为1∶64, 与对照品相同, 均具有免疫活性.

2.8不同批次甘露聚糖肽原料的1H NMR谱分析

由于MT1-A, MT1-B和MT2-B的单糖组成、 糖残基连接方式与MT2-A几乎完全一致, 但分子量和氨基酸总量有所不同; 且4种均一糖肽均具有免疫活性, 因此推测甘露聚糖肽是由糖链结构一致、 分子量和氨基酸含量不同的几种均一糖肽构成的混合物.

为了验证甘露聚糖肽原料中是否还存在其它种类的糖肽或多糖, 测定了该批次甘露聚糖肽原料的1H NMR谱(图S5, 见本文支持信息). 可见, 甘露聚糖肽原料的1H NMR谱与4种均一糖肽的谱图峰型及峰位移值几乎完全一致. 为了定量评价甘露聚糖肽原料和4种均一糖肽1H NMR谱的相似程度, 以MT2-A的1H NMR谱为标准谱图, 异头氢区域δ5.80～4.40为鉴定区域, 采用相关系数法计算甘露聚糖肽原料及另外3种均一糖肽谱图与MT2-A谱图的相似度, 结果列于表2, 可见各相关系数均大于0.95.

进一步测定了其它批次甘露聚糖肽原料的1H NMR谱, 并计算了原料谱图与MT2-A谱图的相关系数, 得出了相同的结论. 上述结果表明, 发酵法得到的甘露聚糖肽是由几种糖链结构一致、 分子量和氨基酸含量不同的均一糖肽组成的混合物. 即使甘露聚糖肽原料中含有其它不同单糖组成或不同连接方式糖残基的多糖或糖肽, 含量也应该很低, 在1H NMR谱中未显示相关信号.

3结论

通过对甘露聚糖肽原料分离得到的几种均一糖肽的结构和免疫活性的测定以及对不同批次甘露聚糖肽原料1H NMR谱的分析, 发现甘露聚糖肽是由糖链结构一致、 分子量和氨基酸含量不同的几种均一糖肽构成的混合物. 在甘露聚糖肽的质量标准中可对其作如下定义: 甘露聚糖肽是由健康人咽喉部分离的α-溶血性链球菌33号菌株经深层培养、 发酵提取而得到的一种糖肽类物质, 主要由甘露糖组成, 还含有少量葡萄糖及氨基酸. 糖链主链由1,6-甘露糖残基构成, 支链由1,2-, 1,3-和末端连接的甘露糖残基构成, 在1,2,6-甘露糖残基的O-2位形成分支点.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160138.

参考文献

[1]Hu Q. L.,Wang Y. S.,ChineseJournalofAntibiotics, 1991, 16(2), 151—156(胡其乐, 王浴生.中国抗生素杂志, 1991, 16(2), 151—156)

[2]Zhang Z. H., Xie W., Ji R., Guo Y. F., Sheng Y. C., Mei Q. B.,ChineseJournalofHospitalPharmacy, 2012, 32(1), 35—40(张朕华, 谢炜, 吉蕊, 郭月芳, 盛雨辰, 梅其炳. 中国医院药学杂志, 2012, 32(1), 35—40)

[3]Wang Y. S., Wang X. Y.,ChinaPharmacist, 2014, 7(4), 302—305(王允生, 王晓燕. 中国药师, 2014, 7(4), 302—305)

[4]Liu Z. S., Wang T. J., Wu G. M., Han C. M.,ChineseJournalofGerontology, 2011, 31(22), 4356—4357(刘忠山, 王铁君, 吴国民, 韩成敏. 中国老年学杂志, 2011, 31(22), 4356—4357)

[5]Liu Y., Huang J., Lu Y. H., Shu Y., Bian C. Y., Fang J. R., Hu T.,MedicalRecapitulate, 2012, 18(18), 3071—3074(刘艳, 黄晶, 路永红, 树瑜, 卞彩云, 方建蓉, 胡涛. 医学综述, 2012, 18(18), 3071—3074)

[6]Huang J., Lu Y.,ChineseJournalofMedicinalGuide, 2015, 17(2), 156—158(黄瑾, 芦源. 中国医药导刊, 2015, 17(2), 156—158)

[7]Su Q. L., Liu F., Wang D. N., Yuan B., Luo F. M.,ChineseJournalofEvidence-BasedMedicine, 2014, 14(6), 759—764(苏巧俐, 刘峰, 王多宁, 袁波, 罗凤鸣. 中国循证医学杂志, 2014, 14(6), 759—764)

[8]Wang W., Shen Y., Wu J.,ChineseJournalofMedicinalGuide, 2014, 16(11), 1414—1415(王伟, 沈勇, 武洁. 中国医药导刊, 2014, 16(11), 1414—1415)

[9]Song G., Gan X.,Chemistry&Bioengineering, 2007, 24(4), 14—16(宋刚, 干信. 化学与生物工程, 2007, 24(4), 14—16)

[10]Wang H. Y.,JournalofModernMedicine&Health, 2010, 26(21), 3284—3286(王红雁. 现代医药卫生, 2010, 26(21), 3284—3286)

[11]Zhang X. G., Shi J. G., Yan Q. G., Hu H. Y., Li Y. F., Zhang R.,ModernOncology, 2006, 14(13), 264—266(张希国, 师建国, 阎庆国, 胡海洋, 李焱峰, 张蕊. 现代肿瘤医学, 2006, 14(13), 264—266)

[12]Chen D. Y., Tan D. Y.,ChineseJournalofMedicinalGuide, 2014, 16(5), 856—857(陈德意, 谭定勇. 中国医药导刊, 2014, 16(5), 856—857)

[13]Zou J. Y., Xu Y. Z.,ChineseJournalofAntibiotics, 1991, 16(6), 419—426(邹敬源, 徐寅正. 中国抗生素杂志, 1991, 16(6), 419—426)

[14]Li S., Pan C., Xia W., Zhang W. Q., Wu S. Y.,InternationalJournalofBiologicalMacromolecules, 2014, 67, 351—359

[15]Wang Y., Gao Q. P., Li G. R., Chen Y. H., Luo H. M., Gao Y., Jiang R. Z.,Chem.Res.ChineseUniversities, 2011, 27(1), 104—107

[16]Zhang N., Liu Y., Lu J. H., Wang J., Yang S., Zhang N., Meng Q. F., Teng L.R.,Chem.Res.ChineseUniversities, 2012, 28(2), 249—254

[17]Zhang X. H., Liu L. N., Lin C. W.,InternationalJournalofBiologicalMacromolecules, 2013, 59, 184—191

[18]Liu Y., Li Y. F., Zheng K. Y., Fei X. F.,Chem.Res.ChineseUniversities, 2012, 28(3), 449—453

[19]Liu Y., Yin L., Gong G. P., Peng Y. F., Huang L. J., Wang Z. F.,Chem.J.ChineseUniversities, 2016, 37(2), 261—268(刘洋, 殷璐, 龚桂萍, 彭艺芳, 黄琳娟, 王仲孚. 高等学校化学学报, 2016, 37(2), 261—268)

[20]Wang J. H., Zha X. Q., Pan L. H., Luo J. P.,Chem.J.ChineseUniversities, 2013, 34(4), 881—885(王军辉, 查学强, 潘利华, 罗建平. 高等学校化学学报, 2013, 34(4), 881—885)

2.ChengduLierPharmaceuticalCo.,Ltd.,Chengdu610083,China)

(Ed.: P, H, S, K)

† Supported by the Scientific and Technological Achievement Transformation Project of Sichuan Province, China(No.2012SC0024).

Structural Characterization of Mannatide†

SHEN Yanhong1, CHEN Linxiao1, ZHANG Wenqing1, XU Zhizhen1,WAN Yanfei2, ZHANG Li2, XIA Wei1*

(1.ShanghaiKeyLaboratoryofFunctionalMaterialsChemistry,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China;

KeywordsMannatide; Polysaccharide; Structure

AbstractDEAE-52 cellulose column and Sephacryl S-300 gel column were used to isolate and purify mannatide to give four homogeneous glycopeptides termed as MT1-A, MT1-B, MT2-A and MT2-B. The chemical structure of MT1-A, MT1-B and MT2-B were elucidated using monosaccharide composition analysis, methylation analysis,1H-nuclear magnetic resonance(1H NMR) spectroscopy, infrared(IR) spectroscopy and amino acids analysis. It was concluded that the monosaccharide composition and connection type of sugar residues of MT1-A, MT1-B and MT2-A were the same as MT2-A reported before while the molecular weight and amino acid content of four homogeneous glycopeptides were slightly different. The1H NMR spectrum of MT2-A was regarded as the standard reference spectrum and the anomeric region of each spectrum(δ4.89—5.90) was selected as the identification region. The1H NMR spectra of MT1-A, MT1-B, MT2-A and different batches of mannatide were compared with the standard reference spectrum, using the correlation coefficient to quantitatively calculate the similarity. The results showed that mannatide was a mixture of several kinds of homoge-neous glycopeptides with the same glycan structure but different molecular weight and amino acid content.

收稿日期:2016-03-08. 网络出版日期: 2016-05-26.

基金项目：四川省科技成果转化项目(专项)(批准号: 2012SC0024)资助.

中图分类号O629.12

文献标志码A

联系人简介: 夏玮, 女, 博士, 副教授, 主要从事天然产物的开发研究. E-mail: xiawei1999@ecust.edu.cn