应用DNA条形码技术鉴定中药材酸枣仁＊

任 莉，陈新连，石林春，辛天怡，庞晓慧

（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

应用DNA条形码技术鉴定中药材酸枣仁＊

任 莉，陈新连，石林春，辛天怡，庞晓慧＊＊

（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

目的：利用DNA条形码鉴定技术对中药材酸枣仁及其混伪品进行分子鉴定。方法：对研究材料进行DNA提取、PCR扩增和双向测序，利用CodonCode Aligner拼接后，将所得序列转换为彩色条形码图片及二维DNA条形码。用软件MEGA进行遗传距离分析，构建NJ（邻接）树。结果：酸枣仁基原植物酸枣的ITS2序列种内遗传距离为0-0.009，远小于其与混伪品的种间遗传距离（0.084-0.190）；由所构建的NJ树可以看出，酸枣不同来源的样本聚在一起，表现出单系性。结论： ITS2 条形码能够有效地鉴别酸枣仁药材与其混伪品，为保障其用药安全提供新的技术手段。同时，专属二维DNA条形码可以跨平台快速获取酸枣仁的DNA条形码信息，实现对该药材市场流通的数字化监控。

酸枣仁 ITS2 分子鉴定 二维码 DNA条形码

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子，其性平，味甘、酸，具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津的功效，临床用于治疗多种类型失眠症和神经衰弱[1，2]。现代药理学研究表明：酸枣仁具有抗焦虑、抗抑郁、抗衰老等作用，还能降血脂及防治动脉硬化[3-6]。近年来，随着对酸枣仁药理作用研究的深入，其临床应用更加广泛，市场需求量增大，其药材混伪现象日益严重。最常见混伪品有其同属植物滇刺枣Ziziphus mauritiana Lamarck的种子理枣仁及同科植物北枳椇Hovenia dulcis Thunb. 的种子枳椇子[7]。理枣仁为云南地区习用品，其他各地不用，不应做酸枣仁药用；枳椇子为少常用中药，是止咳除烦、清湿热解酒毒的药材，与酸枣仁功效用途不同，三者若区分不清将会严重影响酸枣仁的药材质量[8]。因此，为确保药材质量以及临床用药安全有效，准确鉴别酸枣仁及其混伪品十分必要。

目前，已有研究对酸枣仁的性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱、紫外、红外、RAPD分析和FTIR指纹图谱等进行了报道[9-13]。DNA 条形码鉴定技术在酸枣仁鉴定方面尚无相关报道。由于该方法具有操作简单、快速准确等特点，已成为近年来生物分类和鉴定的研究热点[14-21]。其中，以ITS2为主，psbA-trnH为辅的药用植物条形码鉴定体系一经提出便得到广泛关注与认可，现已纳入《中国药典》[22-27]。郭力城等[28]利用ITS2条形码对中药材金沸草、旋覆花及其近缘混伪品进行了鉴定研究，发现ITS2条形码可有效鉴别多基原药材金沸草和旋覆花及其同属近缘混伪品。赵莎等[29]选用ITS2条形码对五加皮进行鉴定研究，发现ITS2条形码可对五加皮进行准确鉴定。于俊林等[30]研究了ITS2条形码对柴胡药材鉴定的准确性，结果表明ITS2条形码可准确、稳定地鉴定柴胡。为了解决酸枣仁药材的真伪鉴别问题，本研究首次采用ITS2条形码对酸枣仁药材及其混伪品进行分子鉴定，以期为该药材的准确鉴定和安全用药提供参考。

1 材料

本研究共收集31份实验材料，其中酸枣仁样品29份，包含药材样品26份，原植物样品3份；其混伪品样品2份，包含枳椇1份，理枣仁药材1份。以上所有样品均经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证样本保存于中国医学科学院药用植物研究所。另外，从GenBank下载1条北枳椇的序列，样品信息详见表1。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR扩增及测序

将酸枣种子切成小块，称取20-40 mg，用DNA提取研磨仪（Retsch MM400，德国）研磨2 min （30 次/s）后，采用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.， 中国）提取总DNA。PCR反应体积25 μL，PCR反应体系、ITS2通用引物以及扩增程序参照“中药材DNA条形码分子鉴定指导原则”[23]。PCR产物经纯化后，使用ABI3730XL 测序仪（Applied Biosystems Co.，美国）进行双向测序。

2.2 数据处理

利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，美国）校对拼接测序峰图，并去除其引物区。将所获序列及GenBank下载序列采用HMMer注释方法去除两端5.8 S 和28 S 区段获得ITS2序列[31]。将所得ITS2序列用MEGA5.1分析比对， 确定不同单倍型[32]。将各药材ITS2序列基于本课题组编写的代码转换为彩色条形码图片，并基于开源代码PHP QR Code 编码方式对所得ITS2序列及相应物种拉丁名进行编码，将该序列转为二维码图片[33]。基于K2P 模型进行遗传距离分析， 用邻接（NJ）法构建系统聚类树。

表1 样本信息

3 结果

3.1 酸枣仁种内变异分析

本研究中酸枣共29条ITS2序列长度均为221 bp，GC含量为68.3%-69.2%。酸枣序列间存在2个变异位点，分别为88位点C-T变异与94位点A-G变异，分为3种单倍型，种内遗传距离为0-0.009，其主导单倍型序列特征如图1。

图1 酸枣仁DNA条形码及二维DNA条形码图片（ATC■G）

图2 各物种DNA条形码及二维DNA条形码图片（ATC■G）

3.2 酸枣仁及其混伪品种间变异分析

滇刺枣、枳椇以及北枳椇的序列长度分别为218 bp、215 bp和213 bp，GC含量分别为70.6%、69.3%与69.5%，各物种序列特征如图2。酸枣与滇刺枣、枳椇、北枳椇间存在较多变异位点，遗传距离为0.084-0.190，远大于酸枣的种内遗传距离。

3.3 酸枣仁的聚类分析

基于ITS2序列构建酸枣仁及其混伪品的NJ树（图3），可以看出酸枣单独聚为一支，支持率为99%，呈现出明显的单系性，与其混伪品能够明显区分开。由此可见，构建NJ树法可成功鉴别酸枣仁及其混伪品。

图3 基于ITS2 序列构建的酸枣仁及其混伪品的邻接（NJ）树

4 讨论

4.1 酸枣仁的DNA提取

种子类药材在DNA提取过程中，往往存在油脂含量高和粉碎困难等问题。辛天怡等[33]进行中药材二维DNA条形码研究时，去除了研究样品的果皮、种皮，并将其切成小块，再加入PVP-40进行研磨。凃媛等[34]在提取南北葶苈子DNA时，用球磨仪以50 次/s研磨2 min，再利用植物DNA提取试剂盒进行提取。王俊等[35]提取苍耳子药材DNA时，先将苍耳子药材切开，再进行DNA提取。本研究在进行酸枣仁药材DNA提取时，先将其切成小块，再加入样本量10% 的PVP-40。后续按照试剂盒说明书步骤进行操作，一般都能成功提取其DNA，PCR产物电泳后条带单一明亮。

4.2 酸枣仁混伪现象普遍

据文献报道，市场中常见酸枣同属植物滇刺枣的种子理枣仁及同科植物北枳椇的种子枳椇子充当酸枣仁出售[7]。本研究发现酸枣仁混伪现象确实较为常见，从各地市场及药店共收集31份酸枣仁药材样品，利用DNA条形码对收集的样品进行检测，发现有一份样品（DCZ01）不是酸枣，而是滇刺枣，另有一份鉴定结果为枳椇（ZJZ01）。文献报道枳椇子基原植物为北枳椇，但本研究中所获得的酸枣仁伪品经鉴定为枳椇，经查阅文献发现枳椇与北枳椇中文名和拉丁名存在混乱现象，因此本文将枳椇也纳入酸枣仁混伪品行列进行鉴定研究[7，36]。

4.3 酸枣仁二维DNA条形码

根据辛天怡[33]等提出的中药材二维DNA条形码流通监管体系，本研究将所得ITS2条形码转换为彩色条形码图片，形象化展示各药材DNA条形码序列。同时，将所得序列转换为二维码图片，此二维码图片可被不同移动终端的各类二维码扫描软件识读。因此，在酸枣仁种植、加工、收购、零售等各个环节中，均可通过此鉴定体系为每份药材提供专属二维DNA条形码，以便实地抽检与二次核实，保障正品来源。由此可见，通过二维DNA条形码流通监管体系可以跨平台快速获取中药材的DNA条形码信息，实现对中药材市场流通的数字化监督，为解决中药材市场混伪问题提供新的技术手段。

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Identification of Ziziphi Spinosae Semen Using DNA Barcoding Technology

Ren Li, Chen Xinlian, Shi Linchun, Xin Tianyi, Pang Xiaohui
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

This study was aimed to identify Ziziphi Spinosae Semen and its adulterants. DNA of the studied materials was extracted, PCR amplified and bidirectionally sequenced. All sequences were assembled using the CodonCode Aligner. The obtained sequences were transformed into chromatic barcode images and twodimensional DNA barcode. The MEGA software was used in the analysis of genetic distance and the construction of neighbor-joining (NJ) tree. The results showed that the intraspecific genetic distances of internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequences of Ziziphus jujube Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou were from 0 to 0.009, which were much less than the interspecific genetic distances between Z. jujuba var. spinosa and its adulterants (0.084-0.190). The constructed NJ tree showed that samples from different origins of Ziziphi Spinosae Semen clustered into a monophyly clade. It was concluded that ITS2 barcode can effectively identify Ziziphi Spinosae Semen and its adulterants. It provided new technical means to guarantee medication safety. Meanwhile, the exclusive two-dimensional DNA barcode allowed the quick obtaining of cross-platform DNA sequence information for the realization of digital monitoring of this medicine in the market circulation.

Ziziphi Spinosae Semen, ITS2, molecular identification, two-dimensional code, DNA barcoding

10.11842/wst.2016.01.006

R931.5

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-07

＊ 国家自然科学基金面上项目（81573541）：淫羊藿属药用植物超级条形码及其分类学研究，负责人：庞晓慧。

＊＊ 通讯作者：庞晓慧，博士，副研究员，主要研究方向：中药分子鉴定研究。