慢性心力衰竭患者血浆miRNA表达谱分析

李璐，陈群蓉，纪玲

(1.北京大学深圳医院检验科，广东 深圳 518035；2.深圳市宝安区人民医院输血科，广东 深圳 518101)

慢性心力衰竭患者血浆miRNA表达谱分析

李璐1，陈群蓉2，纪玲1

(1.北京大学深圳医院检验科，广东 深圳 518035；2.深圳市宝安区人民医院输血科，广东 深圳 518101)

目的 对慢性心力衰竭(CHF)患者的血浆miRNA进行二代测序，探讨CHF患者血浆中miRNA的表达差异。方法 收集2013年7月至2015年6月间在北京大学深圳医院治疗的40例CHF患者和10例健康对照个体，应用第二代高通量测序技术对其血浆miRNA进行测序，寻找差异表达的miRNA。另收集同期CHF患者和健康对照个体各96例，用逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应对差异表达的miRNA进行验证。结果 与健康对照者相比，高通量测序显示在CHF患者的血浆中miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p和miR-106a-5p的表达水平存在显著上调，miR-31-5p和miR-5091的表达水平存在下调，逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应检测血浆miRNA的表达差异与高通量测序的结果相符。结论 CHF患者的血浆miRNA与健康个体的表达谱存在差异，差异表达的miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p、miR-106a-5p、miR-31-5p和miR-5091或许与CHF的发生有关。

慢性心力衰竭；血浆；miRNA；表达

心力衰竭是心肌损伤引起的心脏结构和功能改变的综合征，是一种复杂的临床症状群，是大多数心血管疾病的最终归宿。随着人口老龄化，冠心病、高血压等发病率的增加，以及心肌梗死救治水平的提升，心力衰竭的发病率逐渐升高，已成为最重要的心血管疾病[1]。我国2003年统计数据显示成人心力衰竭的发病率为0.9%。心力衰竭患者出现症状后，其5年存活率与大多数恶性肿瘤相似[2]。近年来，心力衰竭的治疗有了一些进展，但心力衰竭患者的预后仍无明显改善，因此早期诊断“前临床心衰阶段”的心力衰竭或许能延长心力衰竭患者存活期[3]。微小RNA (microRNA，miRNA)是一类短的不编码蛋白的小RNA分子，长为18～22 nt，miRNA分子通过特异识别靶基因的mRNA分子，在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA可参与调控众多的细胞生物学功能如增殖、凋亡、分化等[4]。本研究将分析慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)患者血浆中的miRNA表达谱，探讨心力衰竭的血浆分子标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年7月至2015年6月间在本院住院治疗的136例CHF患者，其中男性70例，女性66例，年龄(65.16±14.21)岁。所有患者均做二维超声心动图及多普勒超声、心电图、生物学标志物、X线胸片、实验室相关检查，CHF的诊断标准见文献报道[5]。本研究也选取同期来院体检的健康个体106例，其中男性56例，女性50例，年龄(61.47±11.34)岁。所有参与研究的患者及健康个体均被告知所研究的内容，并同意参与本研究。

1.2 RNA抽提及质量鉴定 抽取5 mL外周静脉血于含EDTA-2K的抗凝管中，4℃3 000 r/min离心10 min分离血浆，分离的血浆再于4℃12 000 r/min离心15 min去除细胞碎片，然后再将血浆于4℃25 000 r/min离心10 min，以去除附着在细胞碎片上的核酸。最后于-80℃冰箱冻存血浆。使用Qiagen公司的血浆miRNeasy试剂盒抽提血浆总RNA，具体抽提步骤参见试剂盒说明书。通过实时荧光定量RT-PCR扩增SNORD44引物，鉴定抽提的RNA质量。抽提的RNA于-80℃冰箱保存。

1.3 miRNA测序 使用Illumina公司的smRNA标本文库构建试剂盒，将40例慢性心力衰竭患者和10例健康对照个体的血浆RNA构建成smRNA文库。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出18～30 nt的片段，然后通过T4 RNA连接酶将片段连接到RNA adaptors上(5'-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC和3'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG)，随后使用Superscript II逆转录酶将连接后的片段逆转录成cDNA。将cDNA片段扩增，然后于Illumina Hiseq 2000测序仪上进行测序，miRNA测序由深圳华大基因有限公司进行。

1.4 资料分析 首先去除测序序列的5'adaptor和3'acceptor序列，同时过滤掉低质量和污染序列，剩余合格序列分析长度后通过SOAP 2.0版软件（http:// soap.genomics.org.cn）作图到人基因组GRCh37.p5上。没有碱基错配的Tag才进行分析，与已知miRBase库匹配的tag识别为已知miRNA，非匹配的tag再与Rfam库和piRNA库比对确定其是否为rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、scRNA及piRNA。

1.5 实时荧光定量RT-PCR分析 为了验证miRNA测序资料的可靠性，本研究挑选表达升高和降低的miRNA各一个进行部分验证。验证对象为非测序的另外96例慢性心力衰竭患者和96例健康个体。使用美国GeneCopoeia公司的All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒和引物进行miRNA表达水平的验证。在96孔反应板中进行PCR反应，各反应体系成分组成参见试剂盒说明书，每个血浆标本进行3孔重复反应，取均值。扩增仪为罗氏LightCycler 480Ⅱ。PCR扩增条件为：首先经95℃变性10 min；再进行40个扩增循环，每一循环包括95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s；循环完成后于72℃再延伸5 min。PCR完成后进行熔解曲线分析以监测反应的特异性。以RNU6-2为内参照，计算待测miRNA扩增的ΔCt，确定miRNA的相对丰度。

1.6 统计学方法 患者和健康个体组miRNA扩增的ΔCt值的比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 CHF患者和健康个体的血浆miRNA的表达谱注：表达差异判定标准：log2(Y/X)绝对值≥1.0且P值≥0.78。

2.1 CHF患者和健康个体的血浆miRNA存在差异表达 去除接头和低质量的数据，测序长度在18～30 nt之间，大部分为22 nt，这些测序片段可作图到人基因组、rRNA、tRNA和Rfam数据中，共计测到371个已知的血浆miRNA(图1)。通过比较CHF患者和健康个体的血浆miRNA相对丰度，本研究发现8个miRNA分子存在表达差异，其中miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p、miR-184、和miR-106a-5p的表达水平存在上调，miR-31-5p和miR-5091的表达水平存在下调，见表1。

表1 CHF患者与健康个体差异表达的血浆miRNA

2.2 差异表达的血浆miRNA的RT-PCR验证 本研究选取8个差异表达的血浆miRNA分子中的miR-651-5p(上调)和miR-5091(下调)进行RT-PCR验证。通过RT-PCR扩增，miR-651-5p和miR-5091均成功扩出，扩增曲线见图2和图3。经比较，CHF患者的血浆miR-651-5p表达水平较健康个体上升6.23倍(P＜0.01)，而miR-5091的表达水平下降3.78倍(P＜0.01）。RT-PCR检测的2个miRNA分子的差异表达与高通量miRNA测序结果相符，初步显示高通量miRNA测序结果的可靠性。

图2 miR-651-5p扩增曲线

图3 miR-5091扩增曲线

3 讨论

心力衰竭是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的一组复杂临床综合征，临床主要表现为呼吸困难、乏力、液体潴留，它是各种心脏疾病的严重和终末阶段[6]。根据心衰发生、发展过程，可将之分为前心衰、前临床心衰、临床心衰、难治性终末期心衰4个阶段。心力衰竭是一种慢性进展性疾病，尚无有效治疗手段，但可预防。预防的重要节点有：从前心衰到前临床心衰，从前临床心衰到临床心衰，后一节点的预防在临床尤为重要[7]。因此，在临床若能早期诊断心力衰竭有重要意义。目前临床通过测定血浆利钠肽对心力衰竭进行辅助诊断和鉴别诊断，但特异性和敏感性不高。

miRNA是内源性的非编码小分子RNA，它在进化上高度保守。miRNA有多种生物学功能。体外miRNA比mRNA有更好的稳定性，体内miRNA代谢周期更长，因此更适合作疾病的标记物[8]。笔者通过深度测序40例CHF患者和10例健康对照个体的血浆中小RNA，共发现他们血浆中存在371个已知的血浆miRNA，统计分析发现8个miRNA在CHF患者和健康对照个体的血浆中存在表达水平差异。患者中表达升高的有miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p和miR-106a-5p。表达降低的有miR-31-5p和miR-5091。由于RNA深度测序技术本身的局限性及测序标本数量偏少，笔者选取表达升高的miR-651-5p和表达降低的miR-5091为代表，使用实时荧光定量RT-PCR对深度miRNA测序结果进行部分验证。验证结果与深度miRNA测序结果相符，提示本研究中高通量测序结果的可靠性。华中科技大学附属同济医院通过微阵列芯片研究发现CHF患者血浆中miR-660-3p、miR-665、miR-1285-3p及miR-4491存在表达升高，该研究没有发现表达下调的miRNA。我们的研究结果与之不同，可能是所用方法不同导致的。

经GO聚类分析，这些差异表达miRNA的目标基因主要功能为抗氧化、结合蛋白(可结合蛋白分子、脂类分子及维生素分子)，还有的目标基因表达产物具有酶分子的催化活性。这些目标基因是通过诱发冠心病、高血压病、心肌病的发病进而导致心力衰竭，还是直接导致CHF有待进一步研究。表达上调的miR-184、miR-651-5p、miR-130b-5p、miR-203a-3p、miR-548e-3p和miR-106a-5p能否预测CHF需扩大样本进行验证。

[1]Coma M,González-Moneo MJ,Enjuanes C,et al.Effect of permanent atrial fibrillation on cognitive function in patients with chronic heart failure[J].Am J Cardiol,2016,117(2):233-239.

[2]中华医学会心血管病学会,中华心血管病杂志编辑委员会.慢性心力衰竭诊断治疗指南[J].中华心血管病杂志,2007,35(12):1076-1095.

[3]Koyama T,Watanabe H,Ito H.Respiratory intervention in patientswith chronic heart failure[J].Circ J,2015,80(1):60-61.

[4]Zhu J,Wang S,Zhang W,et al.Screening key microRNAs for castration-resistant prostate cancer based on miRNA/mRNA functional synergistic network[J].Oncotarget,2015,6(41):43819-43830.

[5]中华医学会心血管病学会,中华心血管病杂志编辑委员会.中国心力衰竭诊断和治疗指南2014[J].中华心血管病杂志,2014,42(2): 98-122.

[6]Fournier P,Fourcade J,Roncalli J,et al.Homocysteine in chronic heart failure[J].Clin Lab,2015,61(9):1137-1145.

[7]Gheorghiade M,Greene SJ,Butler J,et al.A signature motif mediating selective interactions of BCL11A with the NR2E/F subfamily of orphan nuclear receptors[J].JAMA,2015,314(21):2251-2262.

[8]Mlcochova J,Faltejskova-Vychytilova P,Ferracin M,et al.MicroRNA expression profiling identifies miR-31-5p/3p as associated with time to progression in wild-type RAS metastatic colorectal cancer treated with cetuximab[J].Oncotarget,2015,6(36):38695-38704.

[9]Li H,Fan J,Yin Z,et al.Identification of cardiac-related circulating microRNA profile in human chronic heart failure[J].Oncotarget, 2016,7(1):33-45.

Profiling of plasma miRNA in chronic heart failure patients.

LI Lu1,CHEN Qun-rong2,Ji Ling1.1.Department of Clinical Laboratory,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518035,Guangdong,CHINA;2.Department of Blood Transfusion,Shenzhen People's Hospital of Baoan,Shenzhen 518101,Guangdong,CHINA

Objective To search for differentially expressed plasma miRNAs between patients with chronic heart failure(CHF)and healthy controls by next-generation small RNA sequencing.Methods Forty CHF patients and 10 healthy volunteers were recruited to search for differentially expressed plasma miRNAs in next-generation small RNA sequencing study from Peking University Shenzhen Hospital between July 2013 and June 2015.miRNAs expression were validated in another 96 patients and 96 controls by RT-PCR analysis during the same period.Results Comparing to healthy group,miRNA sequencing showed that miR-184,miR-651-5p,miR-130b-5p,miR-203a-3p, miR-548e-3p,and miR-106a-5p were upregulated and miR-31-5p and miR-5091 were downregulated in CHF patients.The levels of miRNA measured by RT-PCR were consistent with the results obtained from miRNA sequencing technology.Conclusion A differentially expressed miRNA profiling was seen between patients and healthy individuals. The miR-184,miR-651-5p,miR-130b-5p,miR-203a-3p,miR-548e-3p,miR-106a-5p,miR-31-5p,and miR-5091 may be closely involved in the pathogenesis of chronic heart failure.

Chronic heart failure;Plasma;miRNA;Expression

R541.6

A

1003—6350（2016）15—2438—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.009

2016-02-04)

李璐。E-mail:31656416@qq.com