卵泡发育过程中的Wnt信号通路

周团萍，崔毓桂，千日成



卵泡发育过程中的Wnt信号通路

周团萍，崔毓桂，千日成△

【摘要】Wnt蛋白与细胞膜上相应受体结合，引起胞质中β-catenin集聚并向核内转移，激活下游相关靶基因的转录。该信号通路是调节卵泡生长发育的一个关键途径。Wnt2影响β-catenin的细胞定位来调节颗粒细胞的增殖；Wnt4是一个多功能因子，在卵泡发育的许多阶段都有表达并通过多种途径来调节卵泡的生长、发育和成熟。受体Fzd1调节卵丘扩展相关因子的表达。β-catenin还参与合成卵巢甾体激素和黄体的生成。该通路受损时，会引起卵巢早衰、诱发颗粒细胞肿瘤、排卵障碍和黄体功能不足等。阐述经典的Wnt信号通路及其在调节卵泡发育过程中的作用及其分子机制。

【关键词】信号传导；卵泡；甾类；激素类；排卵；黄体形成

△审校者

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：128-131）

卵泡作为卵巢的基本功能单位，其发育过程经过始基卵泡→初级卵泡→次级卵泡→早期窦卵泡→窦卵泡→成熟卵泡。在早期窦卵泡向窦卵泡转变的过程中，伴随着颗粒细胞（granulosa cell，GC）分化形成卵丘细胞（cumulus cell，CC）。卵泡的生长发育是一个复杂过程事件，受到多种因素的精细调节，如垂体促性腺激素[卵泡刺激素（FSH）、黄体生成激素（LH）]、卵巢内生长调节因子[如胰岛素样生长因子（IGF-1）]和甾体激素（如雌二醇和孕酮）参与调节。此外，转化生长因子β（TGF-β）家族、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号机制也参与调节卵泡发育的特定阶段[1]。近年来，Wnts和Wnt信号通路对生殖系统的潜在生理作用日益受到关注。已有研究报道，Wnt信号通路中的因子[如Wnt4、卷曲蛋白4、β-连环蛋白（β-catenin）等]可以导致性腺发育缺陷及多种肿瘤的发生，如颗粒细胞瘤、结肠肿瘤等[2]。就Wnt/β-catenin信号通路参与调节卵泡发育的作用及其分子信号机制进行阐述。

1　 Wnt信号通路

Wnt是一个重要的信号分子，调控多个生物学过程。Wnt蛋白是分泌性的糖蛋白，大小约40 ku，含350个氨基酸残基，分子里含有保守的半胱氨酸残基。在高等脊椎动物中，Wnt家族有19个成员（Wnt1，Wnt2，Wnt2b/13，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a，Wnt9b，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11和Wnt16），均具有分泌型生长因子的特点[3]。Wnt通路还包含10个卷曲蛋白（Fzd1～10）受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP5和LRP6）。靶细胞细胞膜的卷曲蛋白受体也是一种7次跨膜的嵌合膜蛋白，与G蛋白偶联受体结构类似，该受体胞外富含半胱氨酸结构域，通过该区域与Wnt蛋白特异性结合。这些配体、受体大多在颗粒细胞、卵丘细胞中表达，在黄体和卵丘-卵母细胞复合体（COCs）上也有部分表达。Fzd受体主要参与早期胚胎发育、卵泡发育，LRP5和LRP6主要参与排卵及黄体化过程[4]。LRP6是一个多结构域蛋白，含有4个胞外氨基末端表皮生长因子样重复区域和A型低密度脂蛋白受体重复区域，与Fzd受体组成Wnt信号通路的共受体，在果蝇、蟾蜍和小鼠的Wnt信号调控中必不可少[5]。

Wnt信号转导通路包括3条：①经典的Wnt/βcatenin信号通路，在许多发育事件和人类疾病过程中都有重要的意义，主要参与细胞之间的黏附及调控细胞周期；②Wnt/Ca2+信号通路，触发胞内Ca2+及一些Ca2+敏感性激酶，如蛋白激酶C（PKC）、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ（CamKⅡ）的释放；③Wnt/c-Jun氨基端激酶（JNK）通路（也称平面细胞极性通路），通过激活小G蛋白酶，如Rho和Rac因子等，参与细胞骨架重排，调节上皮细胞的极性发育[6]。这3条信号通路之间并不是孤立存在，同一细胞内，3条通路可同时被激活，相互形成一个精细的、错综复杂的Wnt信号网络。参与多个细胞生物学事件，如细胞增殖、凋亡和分化。Wnt在胚胎发育中的作用包括促进胚胎轴的形成及中枢神经系统中轴突的导向和重塑[7]。如果其异常表达，会引起骨质疏松及肝脏、肾脏、皮肤等多种肿瘤和退化性疾病[8-9]。当前研究较多的，与生殖系统关系最为密切的是经典的Wnt/βcatenin信号通路，β-catenin是该通路中的核心成分。

在缺乏Wnt配体的情况下，β-catenin与轴蛋白、腺瘤性结肠息肉病（APC）蛋白、糖原合成酶激酶3β （GSK-3β）和酪蛋白激酶1α（CK1α）结合形成破坏复合体，GSK-3β和CK1α将β-catenin磷酸化。β-TrCP E3连接酶以泛素依赖性的方式降解磷酸化的β-catenin，降低其在胞质中的水平。同时，转录抑制子Groucho与核内T细胞因子（TCF）结合，阻止Wnt靶基因的转录。在存在Wnt配体的情况下，相应的配体与Fzd受体、LRP受体结合，GSK-3β和CK1α介导胞质中的LRP6分子胞内区域磷酸化，磷酸化的LRP6形成1个对接位点与轴蛋白相接合[10]。β-catenin以Dvl方式从破坏复合体中分离出来，引起β-catenin在胞质中聚集，并进入细胞核替代Groucho转录抑制子，与TCF结合并与淋巴细胞增强子（LEF）、B细胞淋巴瘤9（Bcl-9）等形成复合体，激活下游相关靶基因的转录：如原癌基因（MYC）、基质金属蛋白酶7 （MMP-7）和血管内皮生长因子（VEGF），从而发挥多种生物学作用[11]。β-catenin除了在Wnt信号通路中发挥重要作用外，也可以和Ⅰ型钙黏素的胞质区域紧密连接，从而调控钙黏素的结构和功能。有文献报道，破坏钙黏素介导的细胞黏附可导致β-catenin的释放和Wnt信号的激活[12]。轴蛋白不仅是破坏复合体的重要支架蛋白，也是一重要的肿瘤抑制因子。APC蛋白是大分子蛋白，含有3个轴蛋白结合模体，与细胞的极性迁移有关，GSK-3β参与糖代谢过程。

Wnt/β-catenin信号通路在多个水平上被调控，主要受两类拮抗剂的调控：一类是分泌型的卷曲蛋白相关蛋白（sFRP）和Wnt抑制蛋白，sFRP与卷曲蛋白家族的胞外区域结构相似，通过与Wnt配体结合阻断Wnt配体与卷曲蛋白受体的结合，从而抑制Wnt信号通路[13]；另一类是DKK1和WISE/SOST蛋白家族，它们通过Kremen介导的胞吞作用减少细胞膜上LRP5/6的表达，引起相应的转导信号中断[14]。Norrin 和R-spondins（Rspo）这两类蛋白虽然与Wnt不直接相关，但是可以通过Fzd/LRP受体复合物促进Wnt信号的转导。Norrin由NDP基因编码，是Fzd4/LRP5受体复合体的直接配体。脊椎动物基因组主要编码4个Rspo蛋白（Rspo1～4），这些蛋白属于分泌性小分子蛋白，含有2个氨基端成对碱性氨基酸蛋白酶结构域和一个凝血酶致敏蛋白结构域[15]。

Wnt/β-catenin信号通路与其他通路之间也存在相互交流。卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路主要是转导一些关键激素，如胰岛素样生长因子1（IGF1）、FSH的生物学信号，该通路的靶因子之一是GSK-3β。一方面，通过AKT介导的磷酸化作用抑制GSK-3β的活性，维持β-catenin的稳定性。另一方面，AKT可以促进β-catenin向核内转移。此外，磷酸化AKT信号的效应剂FOXO1a因子，导致其从核内输出，随后被蛋白酶降解，失去了抑制β-catenin的能力，促进了βcatenin核内转录活性[2]。FOXO1a通常定位在细胞核，调节细胞特异性靶基因的转录、促进细胞凋亡、阻滞细胞周期[16]。由此可见，PI3K/AKT信号可以有效地促进Wnt/β-catenin通路，这两条信号通路的相互交流可以协同促进颗粒细胞肿瘤的侵袭、生长及转移，并在其他肿瘤（如前列腺、肝脏、皮肤等肿瘤）的发生、发展中也有一定作用[17]。

2　 Wnt信号在卵巢激素合成中的作用

FSH/环磷酸腺苷（cAMP）调节甾体激素关键酶的表达需要β-catenin的参与，这已在小鼠颗粒细胞中得到证实[18]。小鼠颗粒细胞缺失β-catenin，会导致FSH调节芳香化酶（Cyp19a1）及雌二醇（E2）生成的能力下降[19]，从而导致卵巢发育不良、功能减弱。有研究证明，FSH是通过蛋白激酶A（PKA）磷酸化βcatenin第552和第675位丝氨酸激活β-catenin[20]。这表明Wnt信号通路与FSH信号通路在调节卵巢激素合成方面具有协同作用，这可能是通过增加βcatenin蛋白的聚集作用来实现的。此外，牛黄体细胞中β-catenin参与调节甾体激素与LH介导的孕酮合成相关，β-catenin与甾体激素急性调节蛋白（StAR）基因近端启动子相互作用，其转录活性的增加可以促进StAR mRNA的表达及孕酮合成[21]。

3　 Wnt信号通路与卵泡发育

卵丘扩展是卵母细胞成熟过程中最重要的形态学变化之一，Fzd1表达于排卵前的卵丘细胞上，其表达变化与注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）的时间有关。在Fzd1敲除小鼠的颗粒细胞上Fam126a、Slc30a3因子和卵丘细胞上Areg、Ptgs2、Btc等因子表达下调，Reln表达上调。因Fam126a因子的下调是受β-catenin调节的，而敲除zd1小鼠和未敲除小鼠总的及活化型的β-catenin蛋白水平并没有明显差异[22]。这说明Fzd1很有可能是通过影响与卵丘扩展相关因子的表达来调节卵泡发育。

免疫组化显示在小鼠卵泡发育的整个过程中都可以检测到卵巢壁颗粒细胞和卵丘细胞上Wnt2的表达，在人卵丘细胞上也有该因子的表达。在人卵丘细胞上Wnt2通过与受体Fzd9相互作用，募集βcatenin在细胞膜上的表达及促进其黏附连接的形成，以调控人卵泡的生成[23]。Li等[24]通过转染小干扰RNA（siRNA）敲除小鼠Wnt2的表达，引起颗粒细胞增殖减少、GSK-3β在胞质中聚集增加、β-catenin表达下降。相反，构建重组病毒载体超表达Wnt2，可促进颗粒细胞的增殖、GSK-3β在胞质中聚集减少、βcatenin分布改变即细胞膜上表达减少而细胞质和核中表达增加。随后Wang等[25]证明β-catenin在细胞定位上发生变化的部分原因是Wnt2通过上调缝隙连接因子（Gja1）的转录水平，影响了颗粒细胞上缝隙连接蛋白43（Cx43）和细胞间缝隙连接通道（GJIC）的表达，使得β-catenin稳定性得以维持，并向核内转移。这表明Wnt2可以调节小鼠颗粒细胞上βcatenin的定位，并通过Wnt2/β-catenin信号调节颗粒细胞的增殖。

Wnt4因子在卵泡发育许多阶段的颗粒细胞上都有表达，其对苗勒管的形成、间质细胞系的分化和卵泡发育必不可少[26]。为进一步研究Wnt4在卵泡发育过程中的具体作用，Prunskaite-Hyyryläinen等[27]建立小鼠模型，发现Wnt4敲除小鼠出现颗粒细胞凋亡增加、基膜增厚且有碎片、黏附连接Cdh2和缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达减少，证明Wnt4可以通过控制细胞极化过程中某些因子的表达来调节颗粒细胞的功能与细胞外基质的完整性，从而影响卵泡的发育。此外，Wnt4敲除会导致卵巢变小、卵泡数目减少、抗苗勒管激素（AMH）的表达也下降。由于AMH主要表达于窦前卵泡和窦卵泡，抑制始基卵泡的募集、降低生长卵泡对FSH的敏感性，Wnt4信号受损，使AMH表达下降导致卵母细胞提前成熟、卵泡过度募集、卵泡池耗竭，最终引起卵巢早衰（POF）。推测，Wnt4在卵泡发育的早期阶段至关重要，也是促进POF发生、发展的关键因子。也有研究表明Wnt4参与卵泡发育重要过程中许多基因的表达，包括甾体激素（StAR，Cyp11a1，Cyp19，Klf4）的合成、前列腺素（Ptger4和Ptgs2）的合成、组织重构（Prss23，Adamts1 和Adamts5）、血管再生（Vegfa和Thbs1）[28]。

总之，Wnt4是一个多功能因子，可以通过控制细胞极性、基膜完整性、AMH及其他基因的表达来影响卵泡的生长、发育和成熟，对女性正常生育力的保存以及维持卵泡、卵母细胞的正常发育是必不可少的。

4　 Wnt信号通路与排卵和黄体生成

在排卵和黄体化过程中，排卵前LH急剧上升，与膜上LH/hCG受体（LHCGR）结合，激活cAMP/PKA/ cAMP反应元件结合蛋白（CREB）信号通路，使得表皮生长因子（如Areg、Ereg）快速表达并再次激活ERK1/2-C/EBPβ通路，引起排卵和黄体化。Fan等[1]通过Ctnnb1（Ex3）fl/fl和Ctnnb1fl/fl小鼠模型可分别促进及减弱β-catenin的功能来研究其在排卵和黄体化方面的具体作用。发现在注射hCG 4 h后，Ctnnb1（Ex3）fl/fl组小鼠MEK/ERK1/2/RSK蛋白表达下降；48 h后黄体标记因子StAR、Cyp11a1、LHCGR等基因mRNA的表达也受损，血清孕酮水平较对照组也明显减少。推测β-catenin可能影响了LH诱导的CREB的磷酸化，阻止了Areg、Ereg的表达，ERK通路失活，黄体化相关因子表达下调，最终导致排卵障碍、黄体功能不足。Lgr4因子是Rspo蛋白的受体之一，该因子在胚胎及多个组织器官（如肾脏、男性生殖道、子宫等）中广泛表达，可以促进卵巢黄体化、调节男性生殖道的分化，其缺乏引起胎儿生长受限，增加围生期胎儿死亡率[29]。而Pan等[30]报道当Lgr4与Rspo蛋白结合后，可以扩大Wnt/β-catenin信号通路，诱导下游MMP-9的转录，释放肝素结合表皮生长因子（HBEGF）的活化形式，激活EGFR/ERK信号通路，从而促进黄体成熟及颗粒黄体细胞中孕酮的分泌。β-catenin的双重作用，可能与基因及环境的特异性有关：在Areg等基因启动子上，去磷酸化CREB；而在HBEGF启动子上，磷酸化CREB因子、促进其结合；也可能是在排卵和黄体化的不同时间和阶段发挥不同的效应，但这都还需要大量的实验阐明。

5　结语

综上所述，Wnt信号通路在女性生殖系统中的功能复杂，在调节卵泡的正常生长、成熟、排卵和黄体形成过程中都起重要作用。然而，Wnt信号通路并不是孤立存在的通路，而是与其他通路如EGFRERK、PI3K-AKT等通路形成复杂的网络系统，对整个卵泡的生长过程都发挥着重要的调控作用。

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[本文编辑王昕]

·综述·

Wnt Signal Pathway during Folliculogenesis

ZHOU Tuan-ping，CUI Yu-gui，QIAN Ri-cheng. Clinical Center of Reproductive Medicine，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

【Abstract】The transduction of Wnt signal involves the interaction between Wnt and Fzd as well as cooperation with single -pass co -receptors, which induces the β-catenin translocation to nucleus and the transcription of target genes. This Wnt pathway drives the proliferation of granulosa cells via the intracellular βcatenin translocation. Wnt4 is a pleiotropic player during prenatal and postnatal follicular development, maturation and survival. Fzd1 participates in regulating the expression of those genes involved in cumulus expansion.βcatenin also participates in steroidogenesis and luteogenesis. The maladjustment of β-catenin may lead to premature ovarian failure，granulosa cell tumors and luteal phase defects. In this review, we summarized the classical Wnt/β-catenin pathway and its roles in folliclogenesis.

【Keywords】Signal transduction；Ovarian follicle；Steroids；Hormones；Ovulation；Luteinization

收稿日期：（2015-12-15）

Corresponding author：QIAN Ri-cheng，E-mail：rchian@126.com

通信作者：千日成，E-mail：rchian@126.com

基金项目：国家自然科学基金（81370764）；国家973项目（2012CB944703）；江苏省卫生厅项目（ZX201110）；江苏省妇幼保健重点学科（FXK201221）

作者单位：210029南京医科大学第一附属医院生殖医学科