钙蛋白酶对NO介导的糖尿病性血管内皮功能障碍的影响研究进展

王玉婷，张　强，李晨甦，李化生，田菁菁，杨建成*

(1.沈阳农业大学，辽宁沈阳 100866;2.沈阳市畜牧兽医局，辽宁沈阳 110000；3.沈阳204医院；辽宁沈阳 1100043)



钙蛋白酶对NO介导的糖尿病性血管内皮功能障碍的影响研究进展

王玉婷1，张强2，李晨甦1，李化生1，田菁菁3，杨建成1*

(1.沈阳农业大学，辽宁沈阳 100866;2.沈阳市畜牧兽医局，辽宁沈阳 110000；3.沈阳204医院；辽宁沈阳 1100043)

摘要：糖尿病是最常见的代谢病之一，患有糖尿病的个体心脑血管疾病的发病率显著增加。由糖尿病引起的血管内皮功能障碍(ED)的潜在机制尚不明确，激活钙蛋白酶，特别是μ-钙蛋白酶，可增强NO介导的糖尿病ED的炎性反应，同时促进大血管和微血管中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的降解。μ-钙蛋白酶/PKCβ2活化诱导的eNOS-pThr497/495和eNOS使血液中同型半胱氨酸含量升高，从而引起高血糖ED。论文主要综述了钙蛋白酶对NO介导的糖尿病性ED的作用，钙蛋白酶可作为NO介导的糖尿病性ED的一个新的治疗靶点。

关键词：钙蛋白酶；血管内皮功能障碍；一氧化氮；糖尿病

糖尿病(diabetes)是常见的代谢病之一，患有糖尿病的个体心脑血管疾病发病率显著增加。研究表明，内皮功能障碍(endothelialdysfunction,ED)是糖尿病血管并发症的关键环节；同时也加速了糖尿病及其并发症的进程[1]。而内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在ED发病机制中起关键作用，当机体发生ED时，体内NO合成减少，内皮素相对增多，从而引起血管收缩痉挛、平滑肌细胞增生和血管重塑等病理过程[2]。 钙蛋白酶(calpain)主要存在于细胞质中，是一种依赖Ca2+的中性半胱氨酸内肽酶。研究表明在患糖尿病的个体中钙蛋白酶的活性显著升高[3]。而抑制钙蛋白酶的活性可以减缓糖尿病介导的血管损伤、炎症和ED[4]。本文综述了钙蛋白酶对NO介导的糖尿病性ED的作用，钙蛋白酶作为NO介导的糖尿病性ED的一个新的治疗靶的相关研究。

1钙蛋白酶家族

1.1钙蛋白酶家族概述

钙蛋白酶是1964年由Guroff首次发现，1972年Bush等首先在骨骼肌中确认，1976年Dayton等对其进行纯化。目前已发现15种亚型的钙蛋白酶，其中研究较多的是μ-钙蛋白酶m-钙蛋白酶，它们分子量相近，都由两个亚基组成，小亚基相同，而大亚基是2个相关基因的产物，2种大亚基之间存在一定的免疫交叉反应。

1.2钙蛋白酶的激活

研究表明低浓度的Ca2+可以激活钙蛋白酶。但两者表现在最高活性时所需的Ca2+浓度不同，μ-钙蛋白酶所需的Ca2+浓度为1 nmoL/L～12 nmoL/L，而m-钙蛋白酶为250 nmoL/L～750 nmoL/L。例如，在线粒体转运过程中，通过增加线粒体的氧化应激，间接的加强钙蛋白酶对Ca2+的敏感性，从而激活钙蛋白酶[5]；低氧可激活肺动脉内皮细胞中的钙蛋白酶[6]；此外，钙蛋白酶膜定位的调节和磷脂酰肌醇的结合[7]与糖尿病诱导的Na+/H+交换也能激活钙蛋白酶[8]。

1.3钙蛋白酶的基本功能

钙蛋白酶系统广泛作用于动物体内的各个组织，主要由钙蛋白酶、钙蛋白酶抑制蛋白和骨骼肌特异性钙蛋白酶组成。它们参与动物肌肉生长，神经发育，细胞信号转导等生理活动。钙蛋白酶可参与整合素介导的细胞迁移，细胞骨架重构，细胞分化和细胞凋亡等活动[9]。研究表明钙蛋白酶的活化与急慢性糖尿病诱导的ED、神经血管功能障碍和心肌细胞凋亡相关[1]。

2钙蛋白酶对糖尿病性ED的作用

抑制钙蛋白酶活性可影响糖尿病性ED，有研究表明抑制炎性细胞(白细胞)/细胞因子(细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1)与内皮细胞的相互作用[10]。另外，钙蛋白酶可调节血管机械敏感重构。研究发现，机械应力可使钙蛋白酶活性增加[11]。

2.1钙蛋白酶与糖尿病

钙蛋白酶-10、钙蛋白酶-3和μ-钙蛋白酶在糖尿病的发病机制中均发挥重要作用，如胰岛素抵抗，胰岛素分泌，肝糖合成，葡萄糖转运和ED的发生。钙蛋白酶-10是在糖尿病中确定的第一蛋白酶。钙蛋白酶10的多态性与糖尿病易感性，葡萄糖稳态，胰岛素分泌和胰岛素活化相关[12]。肥胖性和胰岛素性糖尿病与骨骼肌中钙蛋白酶-3表达量降低有关[13]。在糖尿病中μ-钙蛋白酶(钙蛋白酶-1)被激活可导致葡萄糖转运障碍和ED的发生[14]。钙蛋白酶抑制剂可减轻高糖诱导的微血管和血管炎症[15]。不同蛋白酶在糖尿病的发病机制中起不同的作用，可见钙蛋白酶抑制剂的选择对糖尿病心血管并发症的治疗起着至关重要的作用。

2.2钙蛋白酶与内皮细胞

在内皮细胞和血管平滑肌细胞中，μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶均有表达。激活钙蛋白酶在血管生成、ED、伤口愈合的发病机制中发挥重要作用[16]。Miyazaki T等[17]研究表明μ-钙蛋白酶对内皮细胞的功能有调节作用，并可保持血管生理功能的完整性。还有研究表明很多因素可增强内皮细胞中钙蛋白酶的活性。例如，血管内皮生长因子可促使人类微血管和牛主动脉内皮细胞中钙蛋白酶活性增强[18]；血管紧张素Ⅱ影响小鼠毛细血管小静脉内皮细胞中钙蛋白酶的活性[19]；氧化低密度脂蛋白可增强内皮细胞中钙蛋白酶的活性[1]；高血糖可增强小鼠微血管和大血管内皮细胞中钙蛋白酶的活性[10]；此外抗氧化剂可降低小鼠肺微血管内皮细胞中μ-钙蛋白酶的活性，但m -钙蛋白酶活性不受影响[20]。

2.3钙蛋白酶与同型半胱氨酸血症

同型半胱氨酸血症(HHcy)是一种反应性血管损伤含硫基的氨基酸，是氨基酸代谢的中间产物，它可以经过甲基化作用转变成蛋氨酸。近年来临床研究认为高同型半胱氨酸血症是心脑血管及外周血管的独立危险因子。血浆中同型半胱氨酸浓度升高是ED发展过程中一个独立的因素。研究表明，糖尿病性心血管疾病的死亡率和发病率与糖尿病患者半胱氨酸血症的患病率和同型半胱氨酸的血浆浓度成正相关[21]。据报道半胱氨酸血症可增强微血管和大血管内皮细胞中μ-钙蛋白酶的活性。研究发现，D-半胱氨酸培养基分别培养人和小鼠主动脉内皮细胞48 h后，D-葡萄糖含量增加，从而激活钙蛋白酶[10]。此外，半胱氨酸血症可诱导μ-钙蛋白酶从胞浆转移到线粒体内，增加了体外培养的大鼠心脏微血管内皮细胞中线粒体内氧化应激的能力[22]。也有研究表明，半胱氨酸血症/高血糖可诱导大血管内皮细胞钙蛋白酶的激活[10]。此外，μ-钙蛋白酶siRNA可显著抑制半胱氨酸血症/高血糖引起的钙蛋白酶活性。然而半胱氨酸血症和糖尿病之间的相互作用以及半胱氨酸血症/糖尿病对心血管疾病的发病机制尚不明确。

3钙蛋白酶与ED相互作用机制

ED发生时，内皮依赖性血管功能下降，血管通透性增加，内皮结构性损害，内皮细胞脱落等。在血管受到生理刺激时，内皮通过释放血管活性物质保持血管的止血作用，如一氧化氮(NO)、前列环素(PGI2)和内皮衍生极化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor，EDHF)[23]。研究表明，钙蛋白酶可调节血管活性物质，进而对ED产生影响。因此，钙蛋白酶对血管舒张作用和机制可能为预防和治疗糖尿病性ED提供依据。

3.1钙蛋白酶对NO的作用

内皮型NO是由一氧化氮合酶(eNOS)水解相关蛋白产生，如热休克蛋白、小窝蛋白[24]、eNOS本身、Akt以及Akt中断蛋白、hsp90和eNOS结合物、P13K/AMPK的调控信号[25]。激活钙蛋白酶可使小窝蛋白-3降解，从而导致eNOS解偶联[26]。 蛋白激酶C(PKC)可激活细胞质中的酶，参与生化反应的调控，又可当做钙蛋白酶裂解和激活的底物，是一种多功能的酶。在糖尿病患者的血管组织中首次发现PKCβ-2，激活PKCβ-2可诱发糖尿病介导的血管炎症和心肌细胞凋亡[27]。PKC是参与糖尿病性ED重要信号分子，通过调节血管扩张剂导致糖尿病性ED的发生。另有研究表明，钙蛋白酶也可作为PKC信号通路的下游靶点[28]。在高糖状态下，PKC抑制剂(BIM-1)可降低钙蛋白酶在小鼠微血管内皮细胞中的活性[29]。研究表明，通过药物抑制或者基因敲除u-钙蛋白酶和PKCβ-2，可阻断同型半胱氨酸血症/高血糖引起的ED[10]。此外，u-钙蛋白酶/pkcβ-2的激活可减少eNOS-pThr495、eNOS和NO的产生，从而加重同型半胱氨酸血症/高血糖引起的ED[10]。

3.2钙蛋白酶对PGI2的作用

PGI2由环氧合酶(COX)通过花生四烯酸代谢产生，也可通过血管内皮细胞和血管平滑肌细胞产生，其合成的主要来源是COX-2。PGI2主要功能是血管扩张和抗血小板凝集。内皮细胞中PGI2含量减少可导致心血管疾病的发病率升高。 在糖尿病中，PGI2可能作用于平滑肌中血栓前列腺受体(TP)，导致内皮性血管收缩。研究表明，钙蛋白酶抑制剂可减少滑膜成纤维细胞中COX-2的降解，另有研究表明，钙蛋白酶抑制剂(PD150606)通过作用于成纤维细胞中的钙蛋白酶，影响IκB泛素化，进一步影响NF-κB的表达量，使COX-2的含量发生变化[31]。因此，有必要研究蛋白酶对糖尿病中PGI2介导的内皮依赖性血管舒张功能障碍的作用。

3.3钙蛋白酶对EDHF的作用

EDHF是小阻力血管张力的主要决定因素。由于EDHF的影响，内皮细胞对eNOS和COX的介导的血管舒张的抑制作用产生耐受性。研究表明，EDHF介导的反应是通过激活K+通道(Kca)启动的，因此在某些疾病状况下，转录修饰后的Kca参与EDHF介导的ED反应[23]。据报道，高盐饮食可加重糖尿病大鼠肠系膜动脉中EDHF介导的ED[32]。此外，在小鼠肠系膜中，通过氧化作用、酪氨酸硝化和钙激活钾通道可减轻同型半胱氨酸血症中EDHF介导的ED[33]。据报道，内源性蛋白酶抑制剂的过度表达对治疗链脲佐菌素(STZ)处理的小鼠主动脉中EDHF介导的ED有所帮助，这表明激活糖尿病中钙蛋白酶可调控EDHF，从而引发糖尿病性ED[34]。钙蛋白酶抑制蛋白的过度表达可改善高糖小鼠主动脉中EDHF介导的ED。

4总结

大量研究表明，激活钙蛋白酶，特别是μ-钙蛋白酶对NO介导的糖尿病性ED有影响。激活钙蛋白酶可减少Hsp90和eNOS的相互作用从而降低NO的生物利用度，并且加速eNOS、eNOS-pThr495的降解。钙蛋白酶抑制剂能够缓解NO介导的糖尿病ED，并且减轻血管炎症反应。高同型半胱氨酸血症可使μ-钙蛋白酶活化从而加重糖尿病性ED。由于钙蛋白酶对PGI2和EDHF在糖尿病中的作用机制尚不完全明确，所以进一步研究钙蛋白酶对NO介导的糖尿病性ED的影响是有必要的，有望为钙蛋白酶可作为NO介导的糖尿病性ED的治疗靶点提供科学依据。

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专论与讲座

Effect of Calpain on NO Mediated Diabetic Vascular Endothelial Dysfunction

WANG Yu-ting1,ZHANG Qiang2,LI Chen-su1,LI Hua-sheng1,TIAN Jing-jing3,YANG Jian-cheng1

(1.ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China；2.ShenyangVeterinaryBureau,Shenyang,Liaoning,110000,China；3.Shenyang204hospital,Shenyang,Liaoning,110043,China)

Abstract:Diabetes is one of the most common metabolic disease.Compared with healthy individuals,the incidence of cardiovascular disease in individuals with diabetes increases significantly.Although domestic and foreign scholars have carried out extensive researches,the potential mechanism of endothelial dysfunction(ED) caused by diabetes mellitus is not clear.Activation of calpain, especially μ-calpain,enhances inflammatory response mediated by NO in diabetic ED,and promotes the degradation of large vessels and microvascular endothelial nitric oxide synthase (eNOS).Study also shows that μ-calpain/PKCβ2 activation induced eNOS-pThr497/495 and eNOS elevate homocysteine levels in the blood,leading to hyperglycemia-induced ED.This article reviewed the effets of calpain on NO-mediated diabetic vascular ED in the hope of calpain as a new therapeutic targets to NO mediated diabetic ED.

Key words:calpain;endothelial dysfunction;NO;diabetes

收稿日期：2015-12-14

作者简介：王玉婷(1990-)，女，辽宁沈阳人，硕士研究生，主要从事动物生理学与生殖内分泌学研究。 *通讯作者

中图分类号:S852.2

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)06-0106-04