MicroRNA研究概述

彭可可，欧阳伶宣，邓朝谦，蒋　元，徐素萍，李晓宁，韦显凯，罗廷荣*

(1．广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2．亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004)



MicroRNA研究概述

彭可可1,2，欧阳伶宣1,2，邓朝谦1,2，蒋元1,2，徐素萍1,2，李晓宁1,2，韦显凯1，罗廷荣1,2*

(1．广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2．亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004)

摘要:MicroRNA(miRNA)是一类真核生物内源性非编码的单链小分子RNA，长约21 nt～23 nt。越来越多的miRNA在动物细胞和植物组织中发现，这些成熟的小分子RNA是从具有发夹结构的前体miRNA(pre-miRNA)剪切出来，通过与靶mRNA分子互补结合而抑制蛋白翻译或导致mRNA降解，从而调控靶基因的表达。miRNA是一类重要的基因调控子，在机体的基因表达调控、细胞分化和凋亡以及抗病毒防御中发挥重要的作用。深入理解miRNA介导的宿主与病毒之间的相互调节作用，对于阐明病毒的致病机理与制定治疗策略具有深远的意义。

关键词:：miRNA；基因调控；抗病毒

MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小分子单链RNA，长约21 nt～23 nt，广泛存在于动植物细胞中，在转录后调控靶基因的表达，并且参与细胞分化、增殖、凋亡和病毒感染等生物学进程的调节。到目前为止，已有数以千计的miRNA在果蝇、线虫、小鼠和人等多种生物物种中发现，研究推测人类30%编码蛋白的基因也受到这些小的非编码RNA的调控[1]。这些miRNA首先在细胞核内转录并转运到细胞质内，然后在RNA内切酶Dicer和Drosha的切割作用下最终形成成熟的miRNA分子。它们通过与靶标基因相结合后降解其mRNA或抑制其mRNA的翻译来调控基因的表达。miRNA能够微调蛋白质的合成，其调节和协调大量基因的功能显示了许多生物学特性，因而深入研究miRNA的调控模式也将有助于我们了解生物体内复杂的调控网络。

1miRNA的发现

最早的microRNA家族成员是1933年Lee RC等[2]从秀丽隐杆线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传试验发现的lin-4，他发现两条大小为22 nt和61 nt的lin-4的转录物，不编码蛋白，这些lin-4 RNAs含有lin-14 mRNA 3′非编码区重复序列的互补序列，以反义RNA-RNA的相互作用来降解其靶mRNA lin-14的表达，导致lin-14蛋白质合成的减少，从而调控线虫的发育。2000年，在秀丽隐杆线虫中鉴定出第2个调控时序性发育的miRNA分子let-7，由于let-7家族成员的序列和功能在物种间高度保守，这也是其成为第1个在人类中发现的miRNA。尽管let-7与其靶基因lin-41mRNA的3′非编码区序列只有部分互补，但最终导致lin-41 mRNA降解[3]。自证明lin-4和let-7能参与线虫时序发育以来, miRNA已经逐渐成为调节mRNA稳定和mRNA翻译的研究热点。

2miRNA的生物合成

国内外对miRNA的生物合成已经有了一定的研究。在哺乳动物细胞核内，RNA聚合酶Ⅱ(RNA-Pol Ⅱ)将基因组转录生成miRNA基因的初级转录物(primary-miRNA, pri-miRNA)，长度有数百个核苷酸，再经核酸酶Drosha加工成70 nt～90 nt具有发夹结构的单个miRNA的前体 (precursor-miRNA, pre-miRNA)，Drosha酶在pre-miRNA的3′端产生一个2 nt突起，通过突起的识别，pre-miRNA由转运蛋白Exportin-5转出细胞核，运送到细胞质，进一步由细胞浆中的核酸酶Dicer加工成成熟的miRNA，大小为21 nt～23 nt[4]。成熟的miRNA与其互补序列互相结合成miRNA-miRNA双螺旋结构，之后，双螺旋解旋，其中一条成熟的miRNA装配进核糖核蛋白(ribonucleo protein，RNP)生成RNA诱导沉默复合物( RNA-induced silencing complex，RISC)，通过与其靶基因碱基互补的方式对靶基因表达发挥调控功能，另一条miRNA发生降解[5]。

3miRNA的作用机制

miRNA存在于基因组基因间隔区或内含子中，这些小分子RNA通过与靶mRNA 3′非编码区以完全或不完全互补的方式结合，指导靶mRNA在特异性位点断裂，减少靶mRNA的转录水平或翻译抑制，从而调控靶基因的表达。miRNA与靶基因调控作用取决于miRNA与靶基因互补配对的两种方式：完全互补和不完全互补。若miRNA与靶基因完全互补配对，则起到降解mRNA的功能；若miRNA与靶基因不完全互补配对，则起到抑制mRNA翻译的功能[6]。研究发现，植物的miRNA多以第1种方式造成mRNA降解；动物的miRNA多以第2种方式抑制mRNA的翻译。有研究发现，单一家族的miRNA可以直接或间接地调节人类14%基因的表达，每个miRNA可以调控许多靶标位点的mRNA，而每个mRNA又会受到多种miRNA的调节，在不同的细胞状态和不同的病理条件下，同一miRNA也可能有不同的调节作用[7]。miRNA表达的主要特点是细胞特异性或者组织特异性，其在不同的物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性，如miR-122在肝脏中高表达，而miR-124在脑组织中特异性高表达。

4miRNA的生物学功能

miRNA能够在转录后调节mRNA表达，是一类重要的基因调控子，miRNA的调节功能主要体现在调节细胞周期、干细胞自我更新过程、细胞分化及生长发育等方面，它在动物的基因表达调控、细胞分化及抗病毒防御中发挥着重要作用。尽管miRNA和病毒引起的疾病之间的联系还没有完全建立，但是最新的研究表明，miRNA与疾病的发生、发展和预后有联系。miRNA由于结构的多样性与进化保守性决定了生理生化功能上的重要性与普遍性，其揭示了非编码区提供给机体的一种新的、重要的调节机制，为新型基因治疗方案的设计、抗病毒疫苗的制备及基因功能分析等方面提供了潜在的应用价值[8]。

5miRNA介导宿主与病毒的相互作用关系

病毒感染使得宿主细胞内的微环境发生巨大变化，会导致宿主细胞基因表达的急剧变化，所以病毒的感染也将改变宿主细胞miRNA的表达模式。并且随着miRNA的深入研究，对宿主和病毒各自编码的miRNA调节宿主和病毒之间的关系上也有了更深一步的认识。其之间的关系包括宿主miRNA的抗病毒感染功能、病毒对宿主的干扰作用、病毒miRNA对自身基因和宿主基因的调节作用等。

5.1宿主miRNA对病毒的作用

宿主编码的某些miRNA能以病毒的mRNA为靶标，增强或沉默细胞内病毒的mRNA，从而调节病毒基因表达，影响病毒的生活周期和致病性[9]。Jopling C L等[10]发现，人类肝脏特异性的miR-122能靶向结合丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV) mRNA 5′非编码区而引起病毒的复制。他们在体外培养细胞中转染miR-122的互补序列使之沉默后，HCV的RNA复制子减少了80%，而当miR-122异位表达后，HCV的数量得到回升，表明miRNA能够提高病毒RNA翻译关键蛋白的数量，与miRNA减少靶mRNA不同，属于复制水平上调控病毒RNA。Hariharan M等[11]发现人体有许多miRNA与靶基因结合后可以抑制人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的复制。有研究发现在对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)不易感的猪血液单核细胞中miR-181的表达量比猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)高达9倍之多，血液单核细胞不表达PRRSV的受体CD163，或者表达水平很低，试验先证实miR-181可以通过靶向PRRSV的基因组RNA而抑制PRRSV的复制，进一步研究表明，miR-181是通过靶向PRRSV受体CD163的mRNA 3′-UTR，下调CD163受体的合成从而抑制PRRSV侵入PAMs[12]。也有报道miRNA可以通过靶向宿主细胞的相关免疫效应分子进而调控病毒的感染或复制[13]。感染了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的患者，在其肝活组织检查和血清中，miR-155的表达量都相对较低，在HBV稳定复制的肝癌细胞系(HepG2.2.15)中，miR-155表达量也下降，随后证实TLR7的表达与miR-155呈正相关，并通过NF-κB途径来诱导miR-155的表达，转染了miR-155的HepG2.2.15细胞中，HBV的病毒量和抗原水平都下降，最后发现miR-155可以靶向宿主的CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBP-β)，从而抑制HBV的复制[14]。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染期间，miR-155可以参与调控机体的天然免疫应答和适应性免疫应答，是一个抗炎症机制的重要的调节因子，基于miR-155的治疗策略有望控制HCV的感染[15]。在病毒感染过程中，miRNA可以作为干扰素刺激产生的抗病毒分子和干扰素及干扰素刺激基因的调节分子[16]，参与宿主的抗病毒防御。有报道IFN-β可以上调miRNA的表达而发挥抗病毒作用，Pedersen I M等[17]研究发现β-干扰素(IFN-β)可以调节细胞的miRNA，抑制HCV的复制，并且IFN-β治疗会导致人类肝脏特异性miR-122的表达显著降低，表明哺乳动物能通过干扰素系统利用细胞miRNA抵御病毒感染。

5.2病毒miRNA的基因调节作用

一些病毒在感染宿主的过程中，能形成含有茎环的二级结构，因而能被宿主细胞内的Dicer酶加工剪切形成病毒miRNA (virus miRNA, vmiRNA)[18]。近年来研究发现，病毒能够利用宿主内源性mRNA合成自身的miRNA，如疱疹病毒、多瘤病毒和逆转录病毒的某些病毒基因组能够编码病毒miRNA，已报道有超过200种病毒编码的miRNA，发现主要在DNA病毒中出现，如腺病毒和猿猴空泡病毒，这两类DNA病毒含有一个单链miRNA，这些vmiRNA在调控病毒基因的自身表达及病毒与宿主的相互作用方面可能起着重要的作用[19]。vmiRNA的生物合成过程与真核细胞miRNA的生成方式一致，vmiRNA的序列相对缺乏保守性，有较高的突变率，使病毒能快速地适应不同的细胞环境变化。vmiRNA对病毒编码区基因产生的调控作用取决于miRNA与靶基因3′非编码区的互补程度，这种调节作用会降低病毒蛋白的表达，vmiRNA在细胞内可参与细胞免疫分子或细胞凋亡的调节作用[20]。研究发现vmiRNA会通过下调宿主细胞的mRNA攻击宿主的防御系统、改变细胞的内外环境，以达到病毒有效的感染致病力，保持长时间的生存力[21]。总之，vmiRNA不仅可以调节自身基因的转录，而且会对宿主细胞的miRNA发挥调节作用，调控宿主细胞mRNA的表达。

6miRNA与siRNA的区别

自1998年Montgomery M K等[22]发现RNA干扰(RNAi)现象以来，重新将人们的视线转移到RNA上来，对小分子RNA的研究给科学家带来了新的思考空间，如siRNA、miRNA的发现给整个生物界带来深远的影响。RNAi介导的基因沉默效应需要siRNA与靶基因序列完全互补才能发挥RNAi效应，这一点与miRNA相区别开来，在大多数情况下，miRNA通过不完全配对的方式多点结合于靶标mRNA的3′-UTR，因而在翻译水平上负调控靶基因的表达[23]。而siRNA则通常仅在单个位点与其靶标以完全互补配对的方式形成双体，因此在互补位点直接介导靶标mRNA裂解，但是病毒可能会通过改变siRNA的靶标序列来逃避RNAi效应[24]。从这个意义来说miRNA的基因沉默作用比siRNA作用更为广泛，也使病毒更难以通过突变的方式来逃避miRNA的特异性沉默作用。

7miRNA的靶标预测

在miRNA的研究中，miRNA与其靶标基因之间的相互作用是一大热点，miRNA的靶标通常是从计算机辅助靶基因预测软件和试验验证两方面来加以研究，预测软件有PicTar、miRanda、miTarget、microTar、RNAhybrid、psRNATarget等，根据miRNA序列与目标靶基因序列结合自由能以及经验模型预测出特定miRNA的靶基因结合位点[25]，目前,miRNA靶基因预测软件预测已知的miRNA靶基因有较高的预测特异性和灵敏度，但存在较高的假阳性率，因此，miRNA是否能切割靶基因最终仍需要试验验证[26]。随着基因组、转录组、蛋白组等组学技术的发展，大规模的靶基因检测技术在以后的研究应用中将会越来越广泛，结合生物信息技术，miRNA靶基因的验证也将更具有针对性。

8miRNA的检测技术

为了更好的研究miRNA的功能，通常需要检测miRNA在组织或者细胞中的表达量，检测方法也越来越具有灵敏性、特异性以及选择性。成熟的miRNA大小只有21 nt～23 nt，并且在细胞中的表达量相对较低，这些特点使得miRNA的检测不同于传统的RNA的检测，应用于检测miRNA的技术有Northern blot检测、实时荧光定量PCR检测、DNA微阵列芯片、利用各种酶活性检测miRNA等[27]，这些技术推动了miRNA的深入研究。其中，实时荧光定量PCR对RNA的检测灵敏度非常高，但由于成熟的miRNA非常短小，因而引物需要特殊的设计。它是利用加长引物反转录PCR来检测miRNA，通过末端转移酶在miRNA分子的3′末端加上Poly A尾巴，再用30个～40个核苷酸大小的Oligo(dT)作为引物进行反转录，得到被延长的cDNA，进而可以使用SYBR Green I进行实时定量PCR。

9miRNA的应用前景

通过对RNAi、siRNA和miRNA大量而深入的研究，人们意识到miRNA介导的基因沉默技术是治疗病毒性感染疾病的一个很有发展潜力的手段。miRNA的优势在于，人们能够运用丰富的分子病毒学知识和成熟的生物信息学技术，推算并证实出miRNA及其靶标的存在[28]；其次，miRNA不同于siRNA，不需要与其靶标碱基序列严格的互补配对，因而病毒逃避miRNA介导的特异性基因沉默机制可能更难实现。但是miRNA作为基因治疗方法也存在一些技术难题，如一些miRNA的靶标位点会被miRNA二级结构或者高度折叠掩盖。

miRNA在动物及人类中存在，与早期胚胎发育、细胞分化、细胞凋亡、脂肪代谢、病毒感染和癌症等多种生物学过程有重要的联系，越来越多的研究表明其在疾病的发生和发展中有着重要的地位。目前已有研究人员根据miRNA具有的序列保守性和前体茎环结构特征，提出了一些识别和预测miRNA的生物信息方法，也得到了生物试验的验证，但是已深入研究的miRNA数量有限，还有许多miRNA有待于研究发现。因而，全面深入地剖析miRNA的发生、作用机理及其功能，会对解读人类和动物的发育、分化、凋亡和病毒感染等重要生物学过程具有指导意义。相信随着研究的不断深入，基于miRNA的转录后基因沉默将会成功应用于功能基因组学的研究以及肿瘤、病毒感染等的基因治疗。

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Introduction to MicroRNA Research

PENG Ke-ke1,2,OUYANG Ling-xuan1,2,DENG Chao-qian1,2,JIANG Yuan1,2,XU Su-ping1,2,LI Xiao-ning1,2，WEI Xian-kai1,LUO Ting-rong1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China;2.StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-bioresources,Nanning,Guangxi,530004,China)

Abstract:MicroRNA (miRNA) is a kind of eukaryote endogenous non-coding small single-strand RNA with a length of 21-23 nucleotides.A growing number of miRNA were found in animal cells and plant tissue.These mature small RNA can regulate the expression of target mRNA,suppress protein translation and cause mRNA degradation through binding with complementary target mRNA,which from precursor miRNA(pre-miRNA) with hairpin.MiRNA is an important gene regulator and play an important role in expression and regulation of organism gene,cell differentiation,cellular apoptosis,and antiviral defense.Among them,the deep understanding of miRNA mediated matual adjustment between host and virus,which have far-reaching significance to clarify the virus pathogenic mechanism and treatment strategy.

Key words:MicroRNA;gene regulation;antiviral

文章编号:1007-5038(2016)04-0110-05

中图分类号:S852.33;Q522.2

文献标识码:A

作者简介：彭可可(1991-)，女，湖南永州人，硕士，主要从事动物传染病防控与分子病毒学研究。*通讯作者

收稿日期：2015-09-10