TGF-β1/Smads信号通路在肝脏纤维化中的作用研究进展

赵卫华 王燕红 丛敏



·综 述·

TGF-β1/Smads信号通路在肝脏纤维化中的作用研究进展

赵卫华 王燕红 丛敏

肝脏纤维化是多种致病因素持续作用于肝脏，导致慢性肝脏损伤后的共同结果。主要表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)生成过多，降解相对不足，在肝脏内大量沉积，导致肝脏纤维化，此病理过程是可逆的。目前认为活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝脏纤维化发生时ECM的主要来源。肝脏中各种细胞生长因子、血管活性因子及脂肪因子均参与了肝脏纤维化的形成与进展，而转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是导致肝脏纤维化的最重要的细胞因子之一。本文将在已知的TGF-β1在肝脏纤维化中的作用基础上，对近3～5年来有关调控因子对TGF-β1/Smads信号通路的影响及靶向TGF-β1信号通路的抗肝脏纤维化治疗策略进行如下综述。

一、TGF-β1概述

20世纪70年代初，在大鼠成纤维细胞培养中发现一种新的多肽被命名为肉瘤生长因子(SGF)，后来发现这个因子是由两个不同功能的物质组合而成，分别命名为转化生长因子-α (TGF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)。TGF-β 是由两个结构相似的二聚体借助分子间的二硫键连接而成。最新研究发现TGF-β有6种类型异构体，而哺乳动物中则有TGF-β1、β2及β3三个亚型，其体外性质类似，但体内效应不同[1]。

在生理状态下，TGF-β1调节组织重建以及凋亡来维持细胞内稳态。在肝脏纤维化发生时，TGF-β1是目前已知最强的促纤维化细胞因子之一，参与了肝脏纤维化的几乎所有关键步骤。TGF-β1的促纤维化作用主要是通过TGF-β1/Smads信号途径实现的[2]。

正常肝脏的实质细胞和内皮细胞并不表达TGF-β1。当存在肝损伤时，骨髓来源的巨噬细胞、库普弗细胞、肝细胞和血小板生成大量TGF-β1，TGF-β1促进HSC活化，而活化后的HSC自分泌TGF-β1也明显增多。目前认为骨髓来源的巨噬细胞与肝脏固有库普弗细胞是TGF-β1的主要来源[3]。

二、肝脏纤维化中的TGF-β1/Smads信号通路及其调控因子

TGF-β1/Smads信号通路是TGF-β1发挥作用的最经典及最常见途径，在肝脏纤维化的启动和肝星状细胞的激活转化过程中起关键作用。Smads蛋白是TGF-β1信号转导途径的中心环节，是TGF-β1受体后信息分子，参与调控细胞的增殖、转化、合成、分泌与凋亡。Smads蛋白是目前所知的最重要的TGF-β1受体胞内激酶的底物。哺乳动物Smads蛋白家族根据其结构和功能不同分为三类：(1)受体调节性Smad(R-Smad)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8，能够结合丝氨酸/苏氨酸受体，是TβRⅠ胞内激酶的特异性底物，该组分子决定了配体信号转导的特异性。(2)通用性Smad(Co-Smad)，只有一个成员Smad4，是不同TGF-β超家族成员信号传递必需的中心转导分子，它能够与活化的R-Smad蛋白结合，并形成低聚体复合物，参与调节TGF-β信号转导。(3)抑制性Smad(I-Smad)，包括Smad6、Smad7，它们可与活化的TβRⅠ牢固结合，抑制R-Smad分子与该受体的结合和磷酸化，从而对TGF-β超家族成员信号转导起负调控作用，因而也称拮抗型Smad[4]。

TGF-β1前体能够与潜态TGF-β结合蛋白(LTBP)结合，当受到活性氧(ROS)、纤溶酶及酸等各种因素影响时，TGF-β1才能从延迟活性肽(LAP)/LTBP复合体中释放出来，发挥生物学效用，传递多种生物学信号[5]。TGF-β有Ⅰ型(TRⅠ)和Ⅱ型(TRⅡ)两个重要的受体。成熟的TGF-β1在发挥作用时首先与TRⅡ结合，诱导其磷酸化再与TRI结合形成二聚体复合物，然后该复合物可使调节受体的Smads蛋白(Smad2和Smad3)磷酸化，磷酸化后的Smads蛋白与结合型Smads蛋白(Smad4)结合为Smads复合物并移位至肝细胞核，再与其他转录因子共同调节靶基因的转录[6]。

miRNA是一种内源性非编码RNA，长度约18～22个核苷酸，通过与mRNA的3-UTRs端互补结合阻遏靶mRNA翻译或者诱导其降解。研究表明miRNAs在细胞凋亡、增殖和分化等基本生命活动中起重要调控作用[7]。目前，在纤维化研究领域，miRNAs引起了人们的广泛关注，miRNAs可通过TGF-β信号通路参与肝脏纤维化过程。

研究发现，很多miRNAs是TGF-β信号通路的下游靶分子。比如，miR-33a有促纤维化作用，TGF-β可通过磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路诱导miR-33a的表达[8]。TGF-β还能通过Smad3信号通路促进miR-31表达，miR-31也是一种促纤维化因子，可以通过下调缺氧诱导因子1抑制分子(FIH1)激活HSC[9]。TGF-β可以通过上调miR-199a抑制肝细胞生长因子(HGF)的表达，促进肝脏纤维化发生[10]。另一方面，TGF-β可以下调一些抗纤维化miRNA(如miR-150)在HSC中的表达，miR-150的抗纤维化作用与其同I型和IV型胶原蛋白基因直接结合的能力有关[11]。

Smad7是众所周知的TGF-β/Smads信号通路的负性调节蛋白。新的研究结果显示，DNA甲基转移酶1(DNMT1)参与了大鼠肝脏纤维化及HSC活化过程，而且能够抑制Smad7的表达。DNA甲基化抑制剂如5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-azadC)可抑制TGF-β1诱导的HSC活化、增殖并降低促纤维化因子及胶原蛋白的表达，而且能够解除TGF-β1对Smad7的抑制作用[12]。这为肝脏纤维化的治疗提供了新的方向，值得深入研究。

Smad3被认为是肝脏纤维化过程中TGF-β活化HSC主要的调节蛋白。近期研究证实Smad3和维生素D受体(VDR)之间的信号通路有相关性[13]。TGF-β信号通路通过核染色质重构来促进VDR与Smad3肝纤维化相关基因结合位点的竞争性结合。据此，VDR配体能够抑制TGF-β诱导的HSC的活化，从而阻止肝脏纤维化的发生。

骨成形蛋白7(BMP-7)是一种多功能的细胞因子，属于TGF-β超级家族的一个分支[14]，TGF-β和BMP-7有共同的下游Smad信号通路，但彼此相互抑制以保持各自生物学活性的稳定。在哺乳动物中，TGF-β通过Smad2和Smad3的磷酸化传递细胞内的信号。在肝脏纤维化过程中，TGF-β1激活Smad2/3，而BMP-7激活Smad1/5/8，然后磷酸化的Smad2/3和Smad1/5/8与Smad4形成异聚体，并转移到细胞核内通过与DNA序列或辅酶因子相互作用来调节基因的转录[15]。

另外，研究证实氧化应激参与了TGF-β1 对HSC的活化，TGF-β1通过上调NADPH氧化酶4(NOX4)的表达来活化HSC[16]。同时，动物实验也证实以NOX1、NOX4为靶标的NADPH氧化酶(NOX)抑制剂可以改善肝脏纤维化[17]。

三、靶向TGF-β1信号通路的治疗策略

TGF-β1/Smads信号转导通路，为TGF-β1的典型信号转导通路，在肝脏纤维化中起到关键作用，如何通过干预TGF-β1信号转导通路达到肝脏纤维化防治目的具有重要临床价值。

TGF-β1/Smads信号转导通路中，Smad2/3特异地转导TGF-β1信息，是TGF-β1促纤维化作用的胞内主要信号转导蛋白。调控Smad2/3蛋白可以阻断TGF-β1信号的继续转导。Park等[18]合成的TGF-β1 Ⅰ型受体激酶(ALK5)抑制剂EW7197，可以抑制TGF-β1/Smad2/3和ROS信号转导通路。

Wang等[19]发现单用Smad7或尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因疗法显著抑制a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和TGF-β1的表达，而Smad7 和uPA联合治疗具有协同作用，疗效更好。

另外，许多miRNA也可以直接或间接地调控TGF-β的表达、合成以及功能。Smad泛素化调节因子2(Smurf2)是一个已知的TGF-β信号通路负调控因子，miR-424通过下调Smurf2表达从而增强TGF-β信号通路[20]。miR-454和miR-146a通过作用于smad4从而减弱TGF-β信号通路，抑制HSC活化[21]。Kruppel样转录因子11(KLF11)是一种TGF-β靶基因，其通过抑制Smad7的转录来增强TGF-β/Smad信号通路，抑制Smad7转录，miR-30通过靶向作用于KLF11间接上调Smad7，从而减弱TGF-β信号通路[22]。相反，miR-17-5p直接靶向作用于smad7，增强TGF-β信号通路，促进HSC活化，其抑制剂可显著减少HSC中TGF-β介导的Col1a1和 a-SMA的表达[23]。此外，miR-200a靶向作用于TGF-β2和β-catenin ，导致a-SMA下调并抑制HSC增殖[24]。miR-21是在一个关于激活蛋白-1(AP-1)和程序性细胞凋亡因子4(PDCD4)的自动调节反馈回路研究中发现的，肝脏纤维化发生过程中该反馈回路能够使miR-21在活化的HSC中保持高表达[25]。应用3,3′-二吲哚甲烷(3,3′-Diindolylmethane，DIM)干扰该反馈回路，直接作用于AP-1，抑制其活性，导致miR-21表达下调，TGF-β信号通路受抑制，肝脏纤维化程度得到改善[26]。

研究证实很多中药制剂具有抗肝脏纤维化的作用，主要通过抑制TGF-β信号通路及HSC活化来发挥作用。例如传统草药槲寄生、黄芪芍药痱子提取液(APE)等均能通过抑制Smad2信号及促进Smad7表达而起到抗肝脏纤维化的作用[27]。众所周知的保肝中药水飞蓟素对CCl4诱导的肝脏纤维化具有很好的保护作用，它在肝脏纤维化过程中的保护机制主要是干扰TGF-β的表达及抗氧化作用[28]。

最近一个新的防治肝脏纤维化的策略是通过自动免疫接种疫苗来抑制TGF-β信号通路，通过接种与载体蛋白交叉结合的TGF-β衍生多肽，使其在动物体内产生抗原性并诱导机体产生高效价的自身抗体，这种方法能够显著抑制HSC中TGF-β信号通路的传导，有效防治CCl4诱导的肝脏纤维化[29]。

四、总结与展望

TGF-β1这一内源性信号分子在肝脏纤维化的发生发展过程中起着关键作用，以TGF-β1为靶标的抗纤维化治疗在未来临床肝脏纤维化防治中具有重要意义。以TGF-β为靶标的慢性肝脏纤维化动物模型的研究成果非常多，但目前仍未应用于临床。其中原因之一为TGF-β在疾病发展进程中的不同时段发挥了不同的作用。肝脏损伤的最初阶段，TGF-β能够增加肝脏的损伤，然后介导HSC的活化和创伤的修复；在肝细胞增殖与修复过程中，TGF-β又发挥了抑制细胞增殖的作用。在肝脏炎症阶段，TGF-β通过调控抑制性T细胞的表型来减轻炎症，在慢性损伤和修复的过程中，TGF-β主要参与组织修复，是组织瘢痕形成的主要原因。在癌前期疾病阶段，TGF-β作为细胞抑制剂可能避免肝癌的形成。在肿瘤的晚期阶段，TGF-β的抗炎作用可以保护癌细胞免受机体的免疫攻击[30]。因此以TGF-β为靶标的慢性肝病的治疗方法需要精确的时间点的评估及细胞类型的干预。其次干预选定的TGF-β下游信号通路分支或TGF-β诱导的细胞应答需要进一步研究。在以后的研究中，我们需要明确在肝脏纤维化过程中TGF-β信号通路的复杂转归，以及TGF-β信号通路调控因子在TGF-β定向治疗中发挥作用的更多细节以利于转化应用于临床病人。

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(本文编辑：张苗)

国家自然科学基金(81570542)，北京市自然科学基金(7142043)，北京市卫生系统高层次卫生技术人才学科骨干资助项目(2013-3-057)

100050 首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心 肝硬化转化医学北京市重点实验室暨国家消化系统疾病临床医学研究中心 通信作者：丛敏，Email:maomao0623@sina.com

2016-06-03)