甘肃地区乙型肝炎病毒基因型分布研究*

何莉莉，张兴旺，王　平，张哲梅，居　军

(1.甘肃卫生职业学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃省人民医院检验中心，甘肃兰州 730000)



·临床研究·

甘肃地区乙型肝炎病毒基因型分布研究*

何莉莉1，张兴旺2，王平2，张哲梅2，居军2

(1.甘肃卫生职业学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃省人民医院检验中心，甘肃兰州 730000)

摘要:目的分析甘肃地区乙型肝炎病毒(HBV)的基因型分布。方法采用型特异性引物-聚合酶链式反应(SSP-PCR)技术对300例HBV DNA阳性患者进行HBV基因分型。结果在300份血清标本中，279份标本被成功分型，其中基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未确定型别21份，占7.0%。不同基因型HBV感染患者间性别、年龄分布及丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；B型HBV感染患者乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性率(40.7%)略高于C型患者(35.5%)，差异无统计学意义(P>0.05)。结论甘肃地区HBV基因型包括B、C、B/C、C/D型，其中C型为优势基因型。

关键词:乙型肝炎病毒；基因型；特异性引物；聚合酶链式反应

乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布具有明显的种族和地域性差异，我国主要以B、C型感染为主，其中北方以C基因型为主，南方以B基因型为主。而甘肃省位于我国西北地区，属于HBV感染高流行区，其HBV基因型分布值得关注。本研究旨在分析甘肃地区HBV基因型的构成情况，为指导临床病情分析及治疗提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料2008年6月至2011年7月甘肃省人民医院肝病和消化科门诊、住院患者及甘肃省肿瘤医院患者共300例，HBV DNA定量检测均为阳性，其中男220例、女80例，年龄15～70岁，40%来自甘肃省兰州市，60%来自甘肃省除兰州市以外的地区。纳入的所有患者诊断均符合2000年第10次全国(西安)病毒性肝炎会议修订的病毒性肝炎诊断标准[1]，均排除其他病毒性肝炎及自身免疫性肝炎。

1.2方法

1.2.1标本采集与处理抽取受检者静脉血2 mL，室温放置30 min自然凝固，3 000 r/min离心10 min，离心半径为8 cm，吸取血清，-20 ℃保存备用。

1.2.2HBV DNA的定量检测HBV DNA定量检测采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)，于LightCycler荧光定量PCR仪(德国罗氏公司)上检测；定量结果大于1.00×103copies/mL则判为阳性。核酸扩增和温度循环条件设置严格按照厂商试剂说明书进行。

1.2.3HBV血清学标志物(HBV-M)的检测HBV-M检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(HBeAb)、乙型肝炎核心抗体(HBcAb)检测使用上海科华公司试剂在全自动酶免分析仪(瑞士Tecan公司)上运行测试，反应程序设置严格按照厂商试剂说明书进行，同时做室内质控。

1.2.4HBV基因分型采用特异性引物-PCR(SSP-PCR)技术进行检测，引物参考文献[2]方法，根据前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条引物，其中2条外引物，8条内引物，包含6种基因型。每条内引物具有型特异性，使得各种基因型PCR产物大小各不相同。所用引物序列见表1，由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.5HBV DNA的提取取待测HBV血清标本各100 μL，加入100 μL核酸提取液A，振荡混匀15 s，1 300 r/min离心10 min，弃上清。再加入50 μL核酸提取液B至沉淀中，振荡混匀10 s，100 ℃保温10 min，13 000 r/min离心2 min，取上清液作为PCR扩增的模板。

1.2.6PCR扩增反应(1)以HBV DNA为模板，用外引物P1与P2进行第1轮PCR。PCR反应体系(25 μL)如下：Taq预混酶12 μL，50 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，双蒸水10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，循环30次；68 ℃延伸10 min，结束反应。同时以蒸馏水为模板扩增作为阴性对照。(2)以第1轮PCR产物为模板，分别以A组引物(B2、BA1R、BB1R、BC1R)和B组引物(B2R、BD1、BE1、BF1)为内引物进行第2轮PCR，检测HBV DNA基因型A、B、C、D、E、F。PCR反应体系(25 μL)如下：Taq预混酶12 μL，50 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，双蒸水10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，结束PCR反应。同时以蒸馏水为模板扩增作为阴性对照。

1.2.7基因型的判断将第2轮PCR产物分别在1.5%琼脂糖中进行电泳后，在紫外凝胶成像系统拍照，根据PCR扩增产物片段大小来判断基因型。

1.3统计学处理采用SPSS18.0统计软件进行数据处理与统计分析，计数资料以例数或百分率表示，采用χ2检验进行比较分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1HBV基因型的构成在300份血清标本中，279份标本被成功分型，其中基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未确定型别21份，占7.0%。基因C型所占百分比高于其他3种基因型，差异有统计学意义(P<0.05)。随机选取基因B、C 型各5份样品及混合基因型C/D 4份样品，均送至大连宝生物工程有限公司进行S序列测序，结果完全符合。

2.2分型成功的标本来源患者特征不同基因型HBV感染患者间性别、年龄分布及丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；B基因型患者HBeAg阳性率(40.7%)略高于C基因型患者(35.5%)，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨 论

笔者采用SSP-PCR对甘肃地区HBV进行基因型鉴定，在300份血清标本中，279份标本被成功分型，基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未确定型别21份，占7.0%；未发现基因型A、E、F存在。结果说明甘肃地区和全国HBV基因型分布相似，也是以B、C型为主，且两者中C型所占百分比更高，基因C型为优势基因型，这与我国有关HBV基因型的报道一致[3-4]。本研究还发现了4例HBV混合基因型C/D感染患者，这可能与甘肃地区的地理位置及少数民族的存在有一定关系。混合基因型B/C和C/D的存在，可能原因是HBV感染者免疫功能低下而获得了二次感染，这有待进一步研究。此外，21例患者未确定基因型别，可能原因分析如下：(1)可能为G或H型；(2)近年来乙型肝炎治疗中新型抗病毒药物的应用导致病毒发生基因突变，而本试验所用引物不适用于突变基因的检测；(3)样品在采集和保存过程中DNA降解。具体原因仍有待于进一步研究。

在本研究中,不同基因型HBV感染患者间性别、年龄分布及ALT水平比较均无明显差异。B、C基因型HBV感染患者HBeAg阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),与国内学者报道存在差异[5]。随着研究的深入,越来越多的研究表明HBV基因型与乙型肝炎的发病机制、疾病转归、抗病毒疗效有密切关系[6-10]。但是，目前关于HBV基因型与HBeAg阳性率、HBV DNA载量、发病年龄及肝功能指标相关性的研究结论不完全一致，尚无定论。除HBV基因型，HBV感染后疾病进程及转归还与抗病毒治疗、机体免疫状态及宿主遗传因素等密切相关，而HBV基因型只是影响疾病进程的重要因素之一。

综上所述，甘肃地区慢性乙型肝炎基因型分布构成包括B、C、B/C和C/D混合型，其中基因C型为优势基因型，符合我国北方城市HBV基因型的流行病学特征。下一步笔者将扩大样本量，进行基因亚型和不同基因型的乙型肝炎患者转归相关性研究，为甘肃地区的乙型肝炎防治提供更多的实验室依据。

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基金项目：甘肃省技术研究与开发专项计划项目(0709TCYA025)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.028

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0647-02

(收稿日期：2015-09-20)