医院分离多重耐药鲍曼不动杆菌耐药基因的研究*

李光荣，卢灵峰，向成玉，杨　葵，邓正华，刘靳波

(西南医科大学附属医院检验科，四川泸州 646000)



·论著·

医院分离多重耐药鲍曼不动杆菌耐药基因的研究*

李光荣，卢灵峰，向成玉，杨葵，邓正华，刘靳波△

(西南医科大学附属医院检验科，四川泸州 646000)

摘要:目的研究多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-Ab)的耐药性及相关耐药基因，为临床抗菌药物的合理选择提供依据。方法采用MicroScan WalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统筛选鲍曼不动杆菌(Ab)98株；采用聚合酶链式反应检测MDR-Ab携带相关耐药基因OXA-23、OXA-24、IMP、VIM、TEM、SHV；并对耐药基因扩增阳性的产物进行DNA序列分析。结果98株MDR-Ab对青霉素类和头孢类抗菌药物的耐药率均为100.0%；对氨苄西林/舒巴坦的耐药率为73.5%，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为55.1%和54.1%，对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐药率分别为100.0%、100.0%和87.8%，对环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐药率分别为89.8%、91.8%和77.6%，对磺胺甲噁唑和利福平的耐药率分别为91.8%和100.0%，对多黏菌素和多黏菌素B的耐药率分别为14.3%和11.2%，对四环素、米诺环素、替加环素的耐药率分别为100.0%、6.1%、4.1%；98株MDR-Ab耐药基因检测，各有70株携带OXA-23和TEM基因， 53株携带VIM基因，41株携带IMP基因，未检测到OXA-24、SHV基因；DNA序列分析结果显示OXA-23、TEM、IMP和VIM 4种基因分别与NCBI序列的同源性为98%、98%、99%和99%。结论该地区临床分离MDR-Ab耐药情况比较严重，耐药基因的携带以OXA-23和TEM为主，携带多种耐药基因是导致 MDR-Ab耐药的重要原因，临床医务人员对Ab感染患者应尽量根据药敏试验结果合理使用抗菌药物。

关键词:鲍曼不动杆菌；多重耐药；耐药基因

鲍曼不动杆菌(Ab)是一类非发酵的革兰阴性杆菌，广泛存在于医院环境和人体皮肤表面，主要引起获得性肺炎、菌血症、尿路感染、继发性脑膜炎等，是医院感染的重要致病菌之一。根据2013年CHINET数据显示，Ab的临床分离率已高于铜绿假单胞菌，位居非发酵菌临床分离率第1位[1]。多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-Ab)指对3种以上不同类型抗菌药物耐药的菌株。随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的大量使用，MDR-Ab在临床中大量出现，给临床抗感染治疗带来极大的挑战。为了解本院MDR-Ab相关耐药基因的存在情况，笔者对本院临床分离的98株MDR-Ab菌株进行了耐药性分析，选取6种具有代表性的耐药基因(SHV、TEM、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24)进行检测，现报道如下。

1材料与方法

1.1菌株来源98株MDR-Ab均来自2012年1月至2014年9月本院收集的临床标本，标本来源：呼吸道标本中分离73株(74.5%)、分泌物标本中分离12株(12.2%)，血液标本中分离5株(5.1%)，其他标本中分离8株(8.2%)；标本来源科室主要为重症监护室(ICU)、呼吸内科和神经外科。

1.2仪器与试剂MicroScan WalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统及其配套试剂(德国西门子公司)、C1000TM Thermal Cycle聚合酶链式反应(PCR)扩增仪与GelDoc XR凝胶成像仪(美国Bio-RAD公司)、PCR引物(上海生物工程有限公司合成)、Taq DNA酶系等(上海生物工程有限公司)、Maker DL500(大连宝生物工程有限公司)。各靶基因引物序列和产物长度，见表1。

P1：特异性引物1；P2：特异性引物2。

1.3方法

1.3.1细菌鉴定及药敏试验98株MDR-Ab均使用MicroScan WalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统鉴定并获得，同时采用该系统检测其对氨苄西林-舒巴坦、阿米卡星、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢泊肟、头孢噻肟、环丙沙星、头孢吡肟、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、左氧氟沙星、哌拉西林、美洛西林、磺胺甲噁唑、妥布霉素、多黏菌素、多黏菌素B、利福平、四环素、米诺环素、替加环素等23种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。所有MDR-Ab经检测鉴定后冻存于-80 ℃冰箱。实验操作及药敏结果判断标准参照2011年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准执行。药敏试验所用质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、鲍曼不动杆菌ATCC19606。

1.3.2MDR-Ab DNA模板制备采用煮沸法提取细菌DNA模板[2]：挑选已分纯单克隆MDR-Ab菌落放入含1 mL生理盐水的EP管中，混匀后在离心半径为10 cm的离心机上8 000 r/min离心2 min，弃上清后加100 μL蒸馏水在漩涡混合器上充分震荡混匀，在干浴锅上95 ℃干浴10 min，再在离心半径为10 cm的离心机上12 000 r/min离心2 min，所得上清液即为检测细菌DNA的模板。

1.3.3反应体系及条件PCR扩增反应体系：总反应体系为25 μL，其中10×缓冲液2.5 μL，25 mmol/L氯化镁(MgCl2)1.5 μL，25 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)0.2 μL，DNA模板2 μL，5 μmol/L P1和P2引物各1 μL，5 U/μL TaqDNA酶0.5 μL，用无菌水补足至总体积25 μL，通过C1000TM Thermal Cycle PCR扩增仪扩增。反应条件：93 ℃预变性3 min，93 ℃变性30 s→53 ℃复性30 s→72 ℃延伸l min，循环35个周期，72 ℃延长5 min。

1.3.4电泳与成像PCR扩增产物经琼脂糖凝胶(1.5%)电泳跑胶，以无菌生理盐水为阴性对照，琼脂糖凝胶上出现目的条带即为基因检测阳性，通过GelDoc XR凝胶成像仪观察并摄像保存。

1.3.5PCR产物的测序PCR扩增阳性的产物送上海铂尚生物技术有限公司纯化、测序，读序软件为Chromas。测序结果与序列比对软件BLASTN与GenBank数据库中的序列进行对比分析。

1.4统计学处理采用WHONET5.6软件进行耐药性分析。

2结果

2.1药敏试验结果98株MDR-Ab对青霉素类和头孢类抗菌药物的耐药率均为100.0%；对氨苄西林/舒巴坦的耐药率为73.5%，对碳青霉烯类抗菌药物中亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为55.1%和54.1%，对氨基糖苷类抗菌药物中庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐药率分别为100.0%、100.0%和87.8%，对喹诺酮类抗菌药物中环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐药率分别为89.8%、91.8%和77.6%，对磺胺甲噁唑和利福平的耐药率分为91.8%和100.0%，对多黏菌素和多黏菌素B的耐药率分为14.3%和11.2%，对四环素、米诺环素、替加环素的耐药率分别为100.0%、6.1%、4.1%。见表2。

R:耐药；I：中介；S：敏感。

2.2基因检测结果对98株MDR-Ab菌进行OXA-23、OXA-24、IMP、VIM、TEM、SHV基因检测，分别有70株(71.4%)携带OXA-23基因和TEM基因，53株(54.1%)携带VIM基因，41株(41.8%)携带IMP基因，28株(28.5%)同时携带TEM、VIM和IMP基因，26株(26.5%)同时携带OXA-23、IMP和VIM基因，26株(26.5%)同时携带OXA-23、TEM和IMP基因，47株(48.0%)同时携带OXA-23、TEM和VIM基因，26株(26.5%)同时携带OXA-23、TEM、IMP和VIM基因，未检测到携带OXA-24、SHV基因的MDR-Ab。

2.3PCR阳性产物电泳结果对OXA-23、VIM、IMP、TEM基因扩增阳性的产物进行琼脂糖电泳，电泳结果见图1～4。

M：DNA分子量标记物DL500；N：阴性对照；1～8：阳性标本。

图1TEM基因的扩增产物电泳

M：DNA分子量标记物DL500；N：阴性对照；1～8：阳性标本。

图2VIM基因的扩增产物电泳

2.4PCR扩增阳性产物测序结果OXA-23、VIM、IMP、TEM 4种基因经PCR扩增后的阳性产物测序结果经BLAST程序对比分析，与NCBI已登录目的基因的同源性分别为98%、99%、99%和98%。

M：DNA分子量标记物DL500；N：阴性对照；1～8：阳性标本。

图3IMP基因的扩增产物电泳

M：DNA分子量标记物DL500；N：阴性对照；1～8：阳性标本。

图4OXA-23基因的扩增产物电泳

3讨论

Ab是引起临床感染的主要病原菌之一，尤其是MDR-Ab菌株的出现常常导致感染者不治身亡[3]。由于其存在广泛且耐药机制复杂，临床分离率逐年升高，尤其容易感染老年患者、重症患者和免疫力低下的患者，给临床抗感染治疗带来很大的困难。

本研究结果显示，MDR-Ab主要来自呼吸道标本(74.5%)，这与国内外大多数报道接近[4]，提示呼吸道是Ab最容易侵袭的部位。标本来源科室主要为ICU、呼吸内科和神经外科，考虑这些科室主要是一些重症患者，住院时间较长，容易进行一些侵袭性操作和激素、免疫抑制剂等治疗，一定程度上造成了MDR-Ab在医院环境的定植和播散。

随着抗菌药物在临床的广泛使用，Ab的耐药情况越来越严重，尤其是MDR-Ab。本次研究的MDR-Ab对大部分常规抗菌药物耐药率均大于73.5%，由此可见本院分离的MDR-Ab耐药情况十分严峻，常规抗菌药物对MDR-Ab已基本失去抗菌作用。亚胺培南和美罗培南是临床常用于治疗Ab感染的碳青霉烯类抗菌药物，但其耐药率已分别达到55.1%和54.1%，这与临床医务人员在治疗Ab感染时经验性选用既往相对敏感的亚胺培南或美罗培南，使耐药菌株不断得到选择性生存有关，应引起临床高度重视。Dinc等[5]研究发现，对于MDR-Ab引起的严重感染，选用大剂量多黏菌素B联合利福平或头孢哌酮/舒巴坦联合米诺环素进行治疗，其耐药性大幅降低，提示联合用药也是治疗MDR-Ab感染的有效方式。本研究还发现，MDR-Ab对部分药物有较低的耐药率，如多黏菌素和多黏菌素B的耐药率分别为14.3%和11.2%，米诺环素和替加环素的耐药率分别为6.1%、4.1%，提示临床医务人员对MDR-Ab导致的感染可以考虑使用这些药物。

目前认为MDR-Ab对大部分抗菌药物的耐药机制是产β-内酰胺酶，β-内酰胺酶主要包括Ambler分类的A、B、C、D 4类酶[6]，超广谱β-内酰胺酶为A类酶，主要包括SHV、TEM和CTX-M等[7]。可水解单环β-内酰胺类和头孢菌素类抗菌药物，但不能水解碳青霉烯类和头霉素，可被β-内酰胺酶抑制剂抑制。B类酶又被称为金属β-内酰胺酶(MBLs)，包括IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、KHM和NDM等[8-9]，由于其高效的碳青霉烯酶活性和对抑制剂较强的抵抗能力，它对β-内酰胺类抗菌药物具有广泛的水解作用。C类酶为头孢菌素酶(AmpC酶)，可由染色体和质粒介导，且插入序列ISAbal的存在可增强AmpC酶的表达[10]。D类酶又叫苯唑西林酶，包括OXA-23、OXA-24、OXA-58等[11]，是β-内酰胺酶中最复杂多样的一种酶，几乎对所有β-内酰胺类抗菌药物高度耐药，能降低Ab菌株外膜蛋白的表达[12]。本研究对98株MDR-Ab菌进行OXA-23、OXA-24、IMP、VIM、TEM、SHV 6种基因检测，主要检测出OXA-23、TEM、IMP和VIM 4种基因阳性，其中OXA-23和TEM基因的检出率都达到了71.4%(70株)，接近汤凤珍等[13]的报道。IMP和VIM基因的检出率分别为41.8%(41株)和54.1%(53株)，另外同时携带3种以上耐药基因的MDR-Ab也多达26株以上。说明本地区耐药基因的携带以OXA-23和TEM为主，另外多种耐药基因的携带是Ab多重耐药的重要原因，这导致了Ab对多种抗菌药物的耐药及各种细菌之间耐药能力的进一步传播。

综上所述，本地区临床分离MDR-Ab耐药情况比较严重，耐药基因的携带以OXA-23和TEM为主，多种耐药基因是MDR-Ab耐药的重要原因。及时了解医院Ab的耐药性及耐药基因携带情况，对于预防、监测并控制医院内Ab感染和传播具有重要意义。临床医务人员对Ab感染患者应避免经验性用药，尽量根据药敏试验结果合理使用抗菌药物。

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Study on multiple drug resistance gene of Acinetobacter baumanii isolated from hospital*

LiGuangrong，LuLingfeng，XiangChengyu，YangKui，DengZhenghua，LiuJinbo△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the drug resistance of multiple-drug-resistant Acinetobacter baumannii(MDR-Ab) and its relative carbapenemases genes,in order to provide references for rational use of antibacterial agents.MethodsA total of 98 strains of Acinetobacter baumannii(Ab) were identified by using the MicroScan WalkAway96 automated microbial identification susceptibility testing system,and the resistance genes,including OXA-23,OXA-24,IMP,VIM,TEM and SHV,were detected by using the polymerase chain reaction.DNA sequences of positive amplification products of the resistance gene were analysed.ResultsThe drug resistance rates of 98 strains of MDR-Ab to penicillin class and cephalosporin class both were 100.0%,to imipenem and meropenem were 55.1% and 54.1% respectively,to gentamicin,amikacin and tobramycin were 100.0%,100.0% and 87.8% respectively,to ciprofloxacin,levofloxacin and gatifloxacin were 89.8%,91.8% and 77.6% respectively,to sulfamethoxazole and rifampicin were 91.8% and 100.0% respectively,to polymyxin B and polymyxin were 14.3% and 11.2% respectively,to tetracycline,minocycline and tigecycline were 100.0%,6.1% and 4.1% respectively.The results of resistance genes detection in 98 strains of MDR-Ab showed that 70 strains carried TEM and OXA-23 gene,53 strains carried VIM gene,41 strains carried IMP gene,while OXA-24 and SHV genes were not detected.DNA sequence analysis showed that the homology of OXA-23,TEM,IMP and VIM genes were 98%,98%,99% and 99%.ConclusionThe condition of antibacterial resistance of MDR-Ab in this area is very serious,and TEM and OXA-23 are the main drug resistance genes.Carrying multiple resistance genes is an important cause of MDR-Ab resistance.The treatment of patients with Ab infection should be based on the results of drug sensitivity test for rational use of antibacterial agents.

Key words:Acinetobacter baumannii；multiple-drug resistantce；drug resistance genes

基金项目：泸州医学院附属医院基金资助项目(14035)。

作者简介：李光荣，男，主管检验师，主要从事微生物和生物化学检验研究。 △通讯作者E-mail：liujb7203@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.010

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0602-04

(收稿日期：2015-11-13)