核酸检测方法在血液HBV-DNA检测中的应用

曾雪珍，叶贤林，曾劲峰

(广东省深圳市血液中心　518035)

·临床研究·

核酸检测方法在血液HBV-DNA检测中的应用

曾雪珍，叶贤林，曾劲峰

(广东省深圳市血液中心518035)

目的研究核酸检测方法在血液HBV-DNA检测中的应用价值。方法选取2006年6月至2012年6月深圳市347 160例血清学检测阴性的献血者血液标本为研究对象，对其实施罗氏COBAS AMPLICOR血液核酸筛查、PCR-微流芯片法、实时荧光PCR法及NOVARTIS TMA进行核酸筛查以统计携带有HBV的血液标本数量，同时，所有献血者追踪检测丙氨酸氨基转移酶和乙型肝炎两对半标志物。结果347 160例血清学检测阴性的献血者通过实施核酸检测，共检测出乙型肝炎表面抗原阴性及HBV-DNA阳性129例，占0.37‰。其中，窗口期19例，占检出总例数14.7%；隐匿性感染110例，占84.3%。结论NAT灵敏度高，能够有效筛选出献血者血液标本中携带的HBV，对保障血液安全具有重要意义，值得在今后临床检测工作中积极推广使用。

核酸扩增技术；乙型肝炎病毒；乙型肝炎表面抗原；脱氧核糖核酸

输血是将献血者的血液通过静脉输注的方式传输至患者体内，以起到良好的辅助治疗作用的一种治疗方法，在当前医疗机构中得到了广泛的应用。然而，在献血者中，乙型肝炎病毒感染组不可避免地夹杂其中，对输血者的身体健康带来了极大的隐患。根据当前医学临床研究可知，乙型肝炎病毒(HBV)是一种脱氧核糖核酸病毒，属于嗜肝DNA病毒科[1]。目前在我国境内HBV感染率约为65%，而乙型肝炎表面抗原携带率约占到了总人口数的7%，乙型肝炎病毒(HBsAg)属于传染性疾病，已经被世界卫生组织列为严重的全球性卫生问题。如何有效降低由血液输注造成的HBV感染率已经成为各国医学界专家学者研究的重要课题。在血液标本检测工作中，核酸扩增技术(NAT)可缩短检测“窗口期”，降低漏检感染病毒率等优点日渐凸显，并且此种方法已经成为西方发达国家病毒筛查工作的重要手段之一[2]。为此，本研究针对核酸检测方法在血液HBV-DNA检测的应用价值展开深入分析，以为该种检测技术的推广使用提供科学依据，现将结果报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取深圳市血液中心2006年6月至2012年6月347 160例血清学检测为阴性的献血者为研究对象，其中男185 470例，占53.4%，女161 690例，占46.6%，献血者年龄18～45岁，平均(31.5±2.5)岁。所有无偿献血者均检测HIV、梅毒阴性；ABO血型根据红细胞表面有无特异性抗原(凝集原)A和B来划分血液类型系统；血液检测标本均是在全密闭状态下采集的。排除非研究区间段提供的血液标本，以及含有乙醇成分的血液标本。

1.2检测方法347 160例献血者血液标本进行HBsAg金标试纸法，丙氨酸氨基转移酶(ALT)采用干化学法测试，合格后将采集到的血液标本置于NAT试管中，以3 000 r/min离心15 min，并放置在4 ℃环境中保存[3]。选定后实施罗氏COBAS AMPLICOR血液核酸筛查方法、PCR-微流芯片法、实时荧光聚合酶链反应(PCR)法及NOVARTIS TMA进行HBV-DNA检测。(1)罗氏COBAS AMPLICOR血液核酸筛查方法。首先对检测血液标本进行核酸全自动提取工作，将所使用的纯化试剂洗涤缓冲液、蛋白裂解液、磁珠等放置在瑞士罗氏COBAS AMPLICOR NAT检测仪上，于汇集池将标本均匀混合后取样500 μL,并且经过阴阳对照之后放入到仪器，等待1 h后提取自动完成的核酸[4]。其次，向标本加入Mn2+溶液和纯化之后的核酸样液，根据NAT检测仪检测步骤要求逐次加入变性液、内标、酶和显色剂自动完成扩增和检测工作，之后由操作人员记录标本的阳性检测结果。(2)PCR-微流芯片法。本研究中采用上海浩源生物科技有限公司生产的PCR检测试剂盒，扩增引物为HBV前C及C区设计引物，正反向扩增引物的序列如下所示：5′-TTG CCT TCT GAC TTC TTT CC-3′,5′-CGA GGG AGT TCT TCT TCT AG-3′。扩增的具体循环条件为：50 ℃环境下120 s；95 ℃环境下预变性5 min，94 ℃ 50 s、50 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s 2个循环，90 ℃ 40 s、50 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s共32个循环[5]。使用DNA500微流芯片来检测PCR扩增物。利用Caliper L 1000微流芯片分析仪实施HBV定量检测，并利用检测仪携带的计算软件计算最终检测结果[6]。(3)实时荧光PCR法。本研究中所使用的PCR混合物包括正向引物(nt1743～1434)5′-ACG TCC TTT GTT TAC GTC GCG T-3′和反向引物(nt1743～1722)5′-CCC AAC TCC TCG CAG TCC TTA A-3′。扩增程序：50 ℃环境下温育120 s，94 ℃ 120 s、60 ℃ 30 s 1个循环，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s共39次循环，在60 ℃条件下进行荧光PCR定量分析[7]。(4)NOVARTIS TMA。采用Novartis Procleix Ultrio Discriminatory TMA对待检测血液标本进行HBV-DNA检测，检测样品严格按照世界卫生组织国际标准品HBV(97/750)进行校准。(5)HBV阳性结果的追踪研究。进行乙型肝炎两对半，ALT检测，HBsAg同时用两种ELISA试剂测定，阳性结果用中和实验确证。

1.3质量控制每天室内质控物由试剂公司合作配置，按试剂说明书要求判读结果有效性。2007年开始参加原卫生部和澳大利亚的室间质评(NRL，2011年后更改为CITAC)。

1.4统计学处理采用Stata11.0统计软件进行处理数据及统计学分析，分类变量资料采用Fisher法，连续变量资料采用两独立样本Mann-WhitneyU检验。所有的统计检验均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1核酸检测结果所有347 160例献血者通过实施核酸检测，共检测出HBsAg阴性、HBV-DNA阳性129例，占0.37‰[95%置信区间(CI)为1∶3 224～1∶2 265，P<0.05]。其中，罗氏COBAS AMPLICOR血液核酸筛查方法检出8例，95%CI为1∶9 124～1∶1 999；实时荧光PCR法检出11例，95%CI为1∶11 779～1∶2 831；PCR-微流芯片法检出3例，95%CI为1∶22 831～1∶1 611；NOVARTIS TMA多核酸检测107例，95%CI为1∶2 463～1∶1 671。

2.2HBsAg阴性及HBV-DNA阳性血清学标志物分布情况本研究共检测出HBsAg阴性，HBV-DNA阳性129例。其中，处于窗口期19例，占检出总例数的14.7%；隐匿性感染110例，占84.3%。所有110例隐匿性感染中乙型肝炎核心抗体(HBcAb)阳性及乙型肝炎表面抗体(HBsAb)50例，占38.8%；HBcAb阳性及HBsAb阳性45例，占34.9%；单纯HBsAb阳性15例，占11.6%。

2.3对核酸阳性结果献血者的追踪结果129例HBV-DNA阳性献血者进行了追踪，成功追踪到42例献血者，其中7例献血者追踪到HBsAg血清转换到阳性的现象，且HBcAb转换为阳性，呈窗口期特征，占总例数的18.0%。

2.4室间质评结果2007年开始每年参加原卫生部临检中心的质评，结果与预期结果完全一致。澳大利亚的NRL共15支编号A～O，按要求与血液标本同等检测，2007年参加3次，其中HBV-DNA、HCV RNA与预期结果完全一致。HIV RNA 第2次N号标本为B亚型稀释标本，首次未检出，后改进探针后检出。2008年参加3次，全部符合，其中第一次L号为HBV和HIV合并感染，HIV载量低于目前所有的检测方法，本实验室均检出。2008年后均为100.0%符合。

3讨论

HBV是一种经血传播，且危害极大的一种病毒性传染病，而引起HBV传播的途径主要有以下几种：血源性传播、医源性传播、母婴传播、生殖细胞传播、密切接触传播(性接触为主)、吸血昆虫(蚊子、臭虫等)传播等[8]。随着病毒防治及健康宣教工作的广泛开展，生殖细胞传播、密切接触传播、吸血昆虫传播等途径所导致的HBV传播率得到了有效控制。因而，血源性传播已经成为乙型肝炎的主要传播途径。特别是当前输血治疗在医疗机构的各个科室中已经得到了广泛的使用，更是进一步加剧了HBV防治工作的压力。

当前我国范围内的大部分血站一直在单纯使用ELISA，并将HBsAg作为HBV感染的献血者筛查手段与指标。但是，血液标本检测过程中由于窗口期、低水平乙型肝炎感染、基因变异等客观因素的存在，使献血者筛查工作并没有取得理想效果，现代输血安全的需要得不到有效满足[9]。所以，如何降低血站血液标本中HBV“窗口期”感染风险已经成为血液检测领域亟待解决的问题。

经过不断开展的临床研究证实，人体一旦遭受到外界病毒感染，通常情况下最先被检测出来的就是病毒核酸。HBV-DNA为乙型肝炎的脱氧核糖核酸，即HBV基因，是当前临床判定乙型病毒性肝炎感染的最直接、特异性较强及反应灵敏度较高的指标。如果献血者血液标本经过检测后发现HBV-DNA结果呈阳性，则提示该献血者体内存在着HBV复制和潜在传染性。而HBV-DNA越高则表示病毒基因复制越严重，传染性随之提升[10]。因此，通过检测HBV-DNA已经成为筛选血站血液标本HBV感染，以及提高输血安全性的关键手段。随着医学技术的快速发展，国外医学界已经广泛采用NAT来缩短病毒基因检测的“窗口期”，实现及时筛查出HBV感染的血液标本的目的。相较于ELISA等血清学检测方法，核酸检测将HBV检测的 “窗口期”由原来的50 d缩短至25 d，血液安全由此可得到更好保障。国外将其应用在临床血液检测工作中的报道已经屡见不鲜。

本研究对347 160例阴性血样献血者在不同时间段分别采用罗氏PCR法，PCR-微流芯片法和实时荧光PCR法及NOVARTIS TMA进行血液核酸常规筛查。共检出129例HBV-DNA阳性标本，阳性总比率为1∶2 691，占0.37‰，明显高于西方发达国家，主要原因是我国为肝炎的高发区，人群中HBsAg携带率为7.18%，HBV流行率高达60%以上。本次检出129例HBV-DNA阳性，其中罗氏COBAS AMPLICOR血液核酸筛查方法检出8例，实时荧光PCR法检出11例，PCR-微流芯片法检出3例，NOVARTIS TMA多核酸检测107例。科华半自动方法由于前期采用离心富集病毒方法，该方法富集病毒效果差，检出比率相应比其他方法低。而NOVARTIS TMA方法由于采用单人份检测，上样量为500 μL，检出的阳性比率较其他方法高。其余方法由于标本采集时间、取样量、提取和扩增方法不同，检出比率稍有不同。尽管各种检测方法检出例数存在着一定程度的差异，但是不可否认的是相较于临床常用的ELISA，其诊断结果的准确性更高，对于临床广泛使用的输血治疗起到了有效的保障。进一步研究发现，检测出的129例HBsAg阴性、HBV-DNA阳性献血者，其中，窗口期患者19例，占检出总例数的14.7%；隐匿性感染110例，占84.3%。所有110例隐匿性感染献血者中HBcAb阳性及HBsAb阴性50例，占38.8%；HBcAb阳性及HBsAb阳性45例，占34.9%；单纯HBsAb阳性15例，占11.6%，进一步证实了现有检测方法存在的弊端与不足。

然而，结合国内外既有研究成果及本科室工作经验，提示NAT推广使用需要解决以下两个问题：首先是持续维持核酸检测运行经费问题。NOVARTIS TMA核酸检测系统检测结果是上述检测方法中最佳的，但是该系统与国内目前血站实验室检测系统存在着明显的数据信息对接问题，缺乏足够的配套资金开展相应的研究。其次，需要明确一个符合标准的实验室规范化检测流程并做好核酸检测实验室质量控制和人员的技术培训工作。由于NAT在国内尚未得到广泛应用，各地区医疗从业人员对其认知与操作步骤存在一定的不足，需要在此方面花费较大精力予以妥善解决。

综上所述，NAT灵敏度高，能够有效筛选出献血者血液标本中携带的HBV，对血液安全起到了重要的保障作用，值得在今后临床检测工作中积极推广使用。

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2016-01-28修回日期：2016-03-18)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.041

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1673-4130(2016)12-1695-03