耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及流行病学研究进展

周义正 综述，李　艳 审校

(湖北省荆州市中心医院　434020)

·综述·

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及流行病学研究进展

周义正 综述，李艳 审校

(湖北省荆州市中心医院434020)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；分子；分型；流行病学

随着抗菌药物甲氧西林的诞生，1960年在英格兰的医院出现了世界上首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，随后的几十年，世界各地陆续报道了各种类型的MRSA，包括医院相关性MRSA(HA-MRSA)、社区相关性MRSA(CA-MRSA)和家畜相关性MRSA(LA-MRSA)。1990年以来携带杀白细胞毒素(PVL)的CA-MRSA克隆株在世界范围内广为传播，并从社区传向医疗机构，2000年后不断报道的LA-MRSA感染病例也加剧了MRSA感染的复杂性[1-4]。为了有效阻止MRSA的蔓延，无论是卫生行政部门，还是医疗机构都在应用检测和监控等系列措施加以控制。MRSA的传播与分子型别相关，但由于MRSA的分子型别众多，这对控制MRSA传播提出了难题，因此了解MRSA的分子型别及流行趋势对有效控制MRSA的传播有重要作用。本文将探讨MRSA分子分型的主要方法，并关注HA-MRSA、CA-MRSA和LA-MRSA的最新流行病学研究进展。

1MRSA分子分型方法

目前，MRSA的分子分型方法主要包括脉冲场凝胶电泳(PFGE)、spa分型、多位点序列分型(MLST)、葡萄球菌染色体mec基因盒(SCCmec)分型、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)等。以上MRSA的分子分型方法各有优势和局限性，但应用最广泛的是前4种方法，下面将主要介绍这4种方法的原理、应用情况、优势和局限性。

1.1PFGE分型PFGE技术对MRSA进行分子分型的原理如下：首先金黄色葡萄球菌的染色体DNA在限制性酶SmaⅠ的作用下进行酶切，接着这些DNA片段在电场可变的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，这些电泳后DNA片段条带的模式可采用特殊的软件依照标准进行比对分析，从而确定待测MRSA是何种分子型别。PFGE是目前对MRSA进行分子分型的最好技术手段之一，其被认为是判断院内MRSA爆发流行或医院间MRSA流行传播的“金标准”；但其存在耗时、昂贵和重复性差等局限性，因此其应用受到了限制。现在只有少数国家，例如美国和荷兰在研究地区性的标准化PFGE方法对MRSA进行分子分型，但这种标准化的PFGE方法尚未在国际上达成一致。

1.2spa分型金黄色葡萄球菌A蛋白由spa基因编码，该基因由一系列长度为24 bp的重复序列组成，重复序列的多少，以及存在的点突变或缺失构成了spa基因的多态性，Frenay等[5]针对spa基因X区域进行序列分析，由此对金黄色葡萄球菌进行分子分型，该方法称为spa分型。spa分型对MRSA基因型别的区分能力介于PFGE和MLST之间，因此其既可用于MRSA的分子进化研究，也可用于监测医院MRSA的爆发流行。由于spa分型仅对单个位点进行序列分析，因此其区分能力低于MLST，但比MLST省时、省力，成本也更低廉。在spa分型的发展中，分别由Koreen等[6]和Harmsen等[7]建立两种不同的命名体系，这造成不同实验室间得到的spa分型数据存在不可比较性，但StaphType软件的出现解决了这个问题，其将两种不同的命名体系统一起来。

1.3MLST分型MLST分型基于金黄色葡萄球菌7个管家基因arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL的序列分析，每个管家基因的序列决定其自己的型别，7个管家基因组成的型别谱决定了金黄色葡萄球菌序列型别(ST)[8]。目前对MRSA进行命名时，通常将MLST分析和SCCmec分型结合起来，例如在德国流行的柏林克隆株被命名为ST45-MRSA-IV。基于相关序列的分型方法(BURST)可以用来定义同源复合物(CC)，当7个管家基因中有5个相同时可认为属于同一CC。MLST分型的优势在于其标准的命名方法和准确性，但其也存在耗时、耗力和成本昂贵等局限性。

1.4SCCmec分型SCCmec是存在于所有MRSA中的一种特殊移动基因组件(MGE),其决定MRSA对甲氧西林的耐药性。SCCmec由3部分组成：(1)mec基因复合体，主要包括mecA操纵子；(2)ccr基因复合体，主要包括染色体盒重组酶基因；(3)J区，即SCCmec两端和中间连接mec与ccr基因复合体的区域，分别被称为J1、J2和J3。根据葡萄球菌染色体mec基因盒国际工作组(IWG-SCC)在其官方网站(http://www.sccmec.org/)的最新报道，被发现的MRSA中mec基因复合体有5种型别，分别被命名为A、B、C1、C2和E；ccr基因复合体有8种型别，分别被命名为ccr1、ccr2……ccr8。根据mec基因复合体和ccr基因复合体的不同型别，目前命名SCCmec型别有11种，即SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ……Ⅺ。早期SCCmec分型是基于探针杂交的方法，现在SCCmec分型的主流方法是多重PCR法或实时荧光定量PCR法，其中多重PCR法因为无需特殊设备和相对较低的成本得到更多实验室的应用。总之，相对于荧光定量PCR，多重PCR对SCCmec的分型更方便且应用更广，但其需要更多的人力且更耗时。

2目前全球流行MRSA的主要分子型别

2.1HA-MRSA的主要分子型别目前报道最多的HA-MRSA的同源复合物是CC5、CC8、CC22、CC30和CC45[9-11]，其中CC5和CC8是全球流行范围最广的同源复合物，这两种同源复合物有各种ST亚型，其分布在全球各地区。CC22也呈现全球流行，CC30-ST36在美国和英国很常见，CC45在美国和欧洲更常见[10-11]。在亚洲地区报道最多的同源复合物是CC8(ST239)、CC5(ST5)和CC22(ST22)[12-13]。CC8(ST239)、CC5(ST5)和CC30在拉丁美洲流行[14]，CC5、CC8和CC30在非洲流行[15]。

2.2CA-MRSA的主要分子型别目前，全世界报道的CA-MRSA的分子型别超过20种，在流行中占显著地位的5种分子型别是ST1-Ⅳ、ST8-Ⅳ、ST30-Ⅳ、ST59-Ⅴ和ST80-Ⅳ。由于ST8-Ⅳ和ST30-Ⅳ型别的CA-MRSA被不断从各大洲检出，因此这两种型别被认为是最具传播活力的分子型别。USA300克隆株是ST8-IV型别的代表和典型的CA-MRSA，其具有以下特点：SCCmecⅣ型，PVL基因阳性，并同时对利福平、复方磺胺甲噁唑、克林霉素和四环素敏感。ST30-Ⅳ型别常被称为西南太平洋克隆株，以前认为该型别是噬菌体80/81型青霉素耐药的金黄色葡萄球菌的子代菌株，但现在的研究表明其与HA-MRSA和EMRSA-16来自相同的祖代菌株CC30。ST30-Ⅳ型CA-MRSA主要流行于澳大利亚、亚洲、南美、欧洲和中东地区，其常导致严重感染，但与其他分子型别的CA-MRSA相比，其敏感的抗菌药物更多。

2.3LA-MRSA的主要分子型别目前已经报道的LA-MRSA的分子型别有ST1、CC5、ST8、ST9、CC97、ST121、CC126等超过10种，其感染的对象包括人类及各种动物，如牛、猪、马、鸟等。

3MRSA流行病学现状

3.1HA-MRSA流行现状MRSA在全球的医院中广为流行，HA-MRSA占医院感染相关性金黄色葡萄球菌的比例在世界各地区不一样，其中最高的分布在美洲、亚洲和马耳他地区，分离率超过50%；其次是中国、澳大利亚、非洲和某些欧洲国家，分离率为25%～50%；有些欧洲地区如荷兰和斯堪的纳维亚的MRSA分离率很低[16]。最近几年，HA-MRSA在欧洲有些国家如奥地利、法国、爱尔兰、英国和希腊的流行呈现下降趋势；HA-MRSA在东亚地区的流行呈现两种趋势，在印度和菲律宾地区保持较低水平，但在斯里兰卡、韩国、越南、泰国、中国台湾和香港地区却保持了很高的水平[17]。最近的一项研究表明，在韩国、中国香港、中国台湾地区和越南流行的克隆株CC8-ST239-Ⅲ-t037和在韩国和斯里南卡流行的克隆株CC5-ST5-Ⅱ-t002已经从医院扩散至社区，从流行病学角度看，这两种克隆株已转变为CA-MRSA[17]。欧洲的一项关于侵袭性金黄色葡萄球菌的研究表明，HA-MRSA是侵袭性感染的最主要的金黄色葡萄球菌[16]。有些HA-MRSA的同源复合物已播散到全球，例如SNP分析表明，CC5同源复合物通过获取SCCmec已在多个地区完成了变异[18]。基因进化研究表明，跨洲和在医院之间传播的HA-MRSA的同源复合物CC8(ST239)已从北美、欧洲、南美和亚洲分离到[19]，该同源复合物在1990年从南美传入欧洲，从泰国传入中国。

3.2CA-MRSA流行现状1999年，在美国的中西部发生了4起致命的儿童感染事件，通过调查，由此揭开了CA-MRSA作为一种新出现MRSA的面纱。2000年初，在美国的运动员和囚犯中出现了CA-MRSA感染的暴发流行，据当时全美11所医院的调查研究表明，97%的CA-MRSA都属于克隆株USA300(CC8-ST8)。USA300克隆株主要导致皮肤及软组织感染(SSTI)，也可导致坏死性肺炎等急性感染。和北美相比，CA-MRSA在欧洲的流行程度要低些，其主要流行株ST80-Ⅳ型基本上从每个欧洲国家都能分离出，这也与USA300克隆株在北美的主要流行不同。CA-MRSA在欧洲的首次报道发生在2003年的希腊，该国也是欧洲CA-MRSA流行最严重的国家[20]。

ST59-Ⅳ型和ST59-Ⅴ型是中国(包括台湾地区)和其他几个亚洲国家流行的CA-MRSA两个主要分子型别[21]，但这两个型别在欧洲、澳大利亚和美国也有发现，ST59-Ⅳ型局限于美国，ST59-Ⅴ型分布在亚洲和澳大利亚。ST1-Ⅳ型主要流行于美国的阿拉斯加州及中西部地区，以及加拿大的中西部地区；在美国部分ST1-Ⅳ型携带PVL基因，但在澳大利亚ST1-Ⅳ型均不携带PVL基因[22]。最近几年，ST772-Ⅴ型(ST1型单位点突变株)在孟加拉国和印度地区成为一种具有不同寻常毒力和耐药性的新型CA-MRSA[23]，且在欧洲和英国的报道也不断增加[24]。

除了以上提到的主要分子型别，CA-MRSA流行株中还有一些比较有意义的型别。例如在韩国流行的ST72-Ⅳ型；偶尔在非洲和亚洲出现的ST88-Ⅳ型；在其他地区很少出现，但在澳大利亚流行的ST93-Ⅳ型；最近在英国报道的来源于动物但感染人的ST97-Ⅴ型；ST152-Ⅴ和ST377-Ⅴ型与中欧和巴尔干半岛流行的CA-MRSA相关；ST75-Ⅳ型在澳大利亚偏远地区的土著居民中限制性局部流行。

3.3LA-MRSA流行现状2003年，原本在猪和牛中流行的，属于CC398同源复合物的LA-MRSA被首次从人体内检出[2]，尽管在美国和亚洲有零星报道，但CC398同源复合物的LA-MRSA主要在来自欧洲。2007年欧洲17个国家的24个实验室共同完成的一项研究显示，属于CC398同源复合物的LA-MRSA占感染人所有MRSA的比例非常小，且与当地牲畜的密度有关，大部分分离的CC398同源复合物的LA-MRSA来自荷兰、比利时、丹麦和奥地利[2]。在德国与荷兰接壤的地区，CC398同源复合物的LA-MRSA分离率较高，可占当地所有分离MRSA的11%～20%，这与当地较高密度的生猪养殖业有关[25-26]。欧洲相关研究的证据表明LA-MRSA未大规模播散到医院，各地出现的LA-MRSA感染人的病例也是由该地区高密度的生猪养殖造成的，侵袭性的LA-MRSA在欧洲较少见[16]。荷兰51家医院的研究表明，属于CC398同源复合物的LA-MRSA比院内感染的其他MRSA要少72%左右[27]。针对德国32个家庭病房的研究表明，虽然MRSA已从医院播散到家庭病房，但还没有证据表明家庭病房中出现了LA-MRSA和CA-MRSA[28]。在欧洲，经常接触牲畜的人携带LA-MRSA很普遍，但引起的感染却不多。荷兰的研究表明，LA-MRSA感染的危险人群包括在养殖场直接接触牲畜的工人和在屠宰场接触生猪的工人[26]。虽然属于CC398同源复合物的LA-MRSA通常能在人体正常定植，但过去几年也有其导致皮肤及软组织感染、心内膜炎、肺炎和坏死性筋膜炎的报道。

4小结

在过去的几十年，MRSA已流行在全球大部分地区的医疗机构，其分离率也快速增加。CA-MRSA的某些型别已在社区广泛传播并播散到了世界许多地区的医疗机构。CA-MRSA的出现及其快速传播对那些低水平流行MRSA的国家来说是一种挑战，MRSA的这种流行病学的改变对公共卫生是严重威胁。所以持续不断采取各种先进方法对感染人或动物的MRSA进行分子流行病学研究是十分必要的，这不仅能为MRSA的感染提供制定合适治疗方案和有效感染防控措施的依据，更能对这种严重威胁人类健康的细菌进行有效监控。

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2016-03-01修回日期：2016-03-28)

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