肠道病毒71型与临床手足口病关系的研究进展*

张　胜，王　杨△，李凌佳 综述，高　辉 审校

(1.昆明医科大学附属延安医院检验科　650051；2.昆明医科大学第一附属医院皮肤科　650032)

·综述·

肠道病毒71型与临床手足口病关系的研究进展*

张胜1，王杨1△，李凌佳2综述，高辉1审校

(1.昆明医科大学附属延安医院检验科650051；2.昆明医科大学第一附属医院皮肤科650032)

肠道病毒71型；手足口病；实验室检测

手足口病(HFMD)是一种常见的由肠道病毒引起的儿童感染性疾病，主要由柯萨奇病毒A型16(CA16)和肠道病毒(EV)71型感染引起。多数患者表现为一种轻微的自限性疾病，少数病例可迅速发展为致命的中枢神经系统并发症，特别是由EV71引起的感染，而小于3岁的儿童是最容易发生EV7感染且中枢神经系统最易受累[1-2]。常伴随脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脑脊髓炎、小儿麻痹症样瘫痪、心肺衰竭，甚至导致死亡，且脑干脑炎恢复后的儿童可能遗留严重的神经病学方面的后遗症[3]。现就EV71的生物学特性、致病机制及实验室检测进行总结。

1EV71分子生物学特性

1.1EV71分子特性肠道病毒和柯萨奇病毒同属于小RNA病毒科肠道病毒属，EV71是无包膜和突起的单股正链小RNA病毒，直径约33～35 nm，病毒基因组长度大约为7.5 kb。病原体由一个60个亚单位的二十面体的衣壳包绕病毒基因组RNA构成，它的基因组包含了一个开放阅读框(ORF)，两端为5′和3′非编码区(UTR)。其中5′非编码区包含了一个涉及RNA复制的四叶式固定结构和一个指导病毒蛋白质翻译的内在核糖体进入位点(IRES)[4-6],在3′-UTR的末端含有多聚腺苷酸尾巴，UTR不仅可以保证病毒蛋白的正常表位，还可以维护病毒基因的稳定性，决定病毒的毒力[7]。而开放阅读框编码一种250×103的多聚蛋白，包括P1、P2和P3三个区，组成病毒衣壳的结构蛋白(VP1、VP2、VP3及VP4)和参与病毒复制的7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C及3D)。其中VP1是最具致病性的也是最重要的一种结构蛋白，其变化是EV71免疫原性的主要决定因素，单个氨基酸的变化可以明显改变免疫反应和中和抗体反应的敏感性；且包含主要的中和表位，可以用于病毒的鉴定和进化分析[8]。EV71 VP1蛋白包含297个氨基酸，大小为32×103，具有“果冻卷”型的β-桶状结构和疏水性口袋因子。分布于病毒表面的VP1β桶状结构区，存在一个深凹，被认为是EV71 病毒的黏附位点，也被称为峡谷样结构[9]。

1.2EV71的生物学亚型EV71被分为3种基因型，分别是A、B和C，其中B和C划分为B1-B5、C1-C5。而一个单独的B0基因亚型最近是在荷兰1963～1967年的回顾性分析中EV71毒株上得以确认。也有研究表明EV71 C4亚基因型应该归类为一种新的基因型D中。此外，突变和重组是EV进化过程中常见的现象，EV3D聚合酶的失真是导致基因组复制过程中突变的主要原因，正是由于高发的突变率和重组率，为临床的治疗和疫苗的研制带来了困难。

2EV71引起HFMD的致病机制

2.1EV71的感染机制及过程发病机制是一个复杂、多步骤过程，病毒和受体的相互作用是激发感染的第一步[10]。EV71起初吸附在细胞表面的吸附因子上，随后进入细胞和受体相互作用，EV71通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞与受体相互作用，细胞内病毒RNA-dependent 翻译，多聚蛋白被2A和3C蛋白酶裂解为结构蛋白和非结构蛋白。非结构蛋白主要参与病毒核酸RNA正负链的合成，其中正链病毒RNA被包装成为衣壳前体，最终成为具有感染性的病毒颗粒[11]。而VP1作为病毒结构蛋白，主要功能是协助病毒感染，结合细胞受体，参与吸附、穿入、脱壳等过程。目前的研究与其有关的有清道夫受体B2(SCARB2)、选择素P糖蛋白配体1(PSGL-1)、人膜联蛋白Ⅱ(Anx2)和硫酸乙酰肝素类糖胺聚糖。其中SCARB2是主要表达于核内体及溶酶体膜的Ⅲ型糖蛋白，分布于重症HFMD患者肺组织支气管上皮、细支气管上皮、炎症细胞及肺泡上皮细胞；PSGL-1表达于骨髓细胞及受激后的T淋巴细胞，作为细胞黏附因子P、E、L高亲和性配体仅分布于重症HFMD患者肺组织炎症细胞，可能在重症HFMD的感染过程中具有一定作用[9]。

2.2EV71致病机制与机体的反应EV71感染后通过病毒编码蛋白酶作用导致宿主蛋白翻译停止，诱导细胞发生凋亡。研究发现EV71可以通过几种机制阻断Ⅰ型干扰素(IFN)的表达，比如降低细胞胞质内病毒RNA感受黑色素瘤分化相关基因S(MDAS)减少Ⅰ型IFN的表达而降低宿主抗病毒反应[12]。相关文献研究数据显示，EV71复制诱导细胞周期停止在S期，停在S期的细胞为EV71的感染提供了优越的条件，这一过程主要是由非结构蛋白3D介导引起，由此能更深一步理解EV71致病的机制。

目前已有研究者通过对原位EV71病毒RNA定位和详细的免疫病理分析发现，严重的感染者炎症细胞在不同的组织中的分布和分类不等，中枢神经系统伴有巨噬细胞和中性粒细胞浸润的EV71感染易导致神经系统病变；另外，在一项伴有脑膜脑炎中枢神经并发症的患者血清中炎性因子与严重程度相关性的病例对照研究中显示，白细胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10、IFN-α和IFN-γ明显升高，可能与EV71感染诱导的中枢病变相关[13]。国内研究结果显示，IL-6和TNF-α参与EV71 感染所致的HFMD发病的病理、生理过程，并与疾病的严重程度有关[14]。

3EV71实验室检测方法

EV感染的检测和血清型鉴别传统方法是病毒分离和免疫荧光检测法(IFA),但是很耗时且需要特殊实验设备[15]。传统EV71的检测最初是依赖病毒培养和鉴定及血清学诊断，但同样是耗时或是很高的假阳性率，现就EV不同检测方法比较如下。

3.1培养病毒培养可以用粪便、咽喉拭子、水泡液体作为标本，粪便被认为是最适合的标本类型，因为它可以更长维持病毒存活，但是运输时间应该尽可能短。分离和培养病毒的传统诊断方法操作较为繁琐，且假阴性率较高，影响临床诊断和治疗。

3.2免疫学检验诊断中和抗体检测，通过与特定血清型抗血清酸发生中和来识别相关血清型，空斑中和试验普遍应用于EV71中和抗体检测。此外，ELISA IgM检测已经应用于快速诊断，从感染后的第一周至数周都保持很高的敏感性[8]。应用ELISA法检测血清EV71 IgM抗体对于现症感染的检查具有重要意义，其有可操作性强、简便快速、准确等优点，在实验室血清抗体检测中应用广泛，对于检测设备的要求不高，适合在基层医院推广。

3.3分子生物学检测目前，核酸检测成为EV病原学检测新的“金标准”，发挥出无可比拟的优势。其是基于PCR原理的一种更快捷、特异和敏感的检测和鉴别EV亚型的试验方法。常用的具有很高特异性和敏感性的用来检测EV71的包括反转录PCR(RT-PCR)、实时定量反转录PCR(qRT-PCR),其次还有内标多重荧光RT-PCR、基因芯片技术等分子诊断技术方法[16]。

3.3.1RT-PCR技术目前临床诊断EV71感染最为常用的方法之一，其可对VP1基因进行扩增和核酸测序，以VP1蛋白作为目标检测抗原，对低载量水平的RNA可以测定，常用来对EV这种RNA病毒感染进行诊断和血清型鉴定。但与qRT-PCR相比，其灵敏度和特异度都不够高，且操作繁琐，测定周期长，具有较高的假阳性率及假阴性率，对临床的诊断和治疗均具有一定的影响，导致其在临床的应用价值不断下降。此外，因其需要先进的设备和昂贵的试剂，很难应用于发展中国家或是现场流行病学调查。

3.3.2qRT-PCR简化了传统的分子诊断过程，提高了灵敏度和特异度，有效地避免了交叉污染和手工操作误差，达到了对检测的各个反应时段的实时监测、定量，被认为是目前检测EV71及EV、CA16的首选方法。

3.3.3其他检测方法一种快速、可靠、经济、有效的核酸扩增分子检测方法——环介导等温扩增法在2000年首次建立[8]，与RT-PCR相比，具有更高的灵敏度和特异度，操作简便快捷，具有广阔的应用前景。此外，有研究显示已成功发现了基于基因检测的高通量二代测序方法可以直接对临床标本进行EV71全基因组测序，以对病毒变异和进化提供重要的认识依据[17]。目前还成功发展和验证了一种敏感的自动化多通路一次性检测实时RT-PCR方法来检测EV，对HFMD的临床管理和暴发流行疫情控制有重要作用[18]。

3.4联合检测相关文献报道RT-PCR与IgM联合检测可以提高EV71感染引起的严重HFMD早期诊断检测率，所以在临床上被强烈推荐[19]，此外，如白细胞(WBC)、降钙素原(PCT)、IL-6、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等项目联合检测在HFMD的早期诊断中的临床价值及有效性也得到了认可[20]。

4小结

虽然近年来对HFMD的临床研究不断深入，但EV71基因型变异，以及其易与其他不同亚型的交叉感染给HFMD的临床的诊疗不断带来新的挑战。随着分子生物学技术的不断发展，相信在不久的将来，EV71的实验室检测可以达到精准医学水平，并能更加成熟地应用于临床，在HFMD的个体化防治中发挥重要作用。

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云南省应用基础研究项目(2014FB080)。

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A

1673-4130(2016)12-1665-03