结缔组织生长因子在糖尿病视网膜病变中的调控机制及研究进展

梁曦达，王　光，陈晓隆

作者单位：(110004)中国辽宁省沈阳市， 中国医科大学附属盛京医院眼科



·文献综述·

结缔组织生长因子在糖尿病视网膜病变中的调控机制及研究进展

梁曦达，王光，陈晓隆

作者单位：(110004)中国辽宁省沈阳市， 中国医科大学附属盛京医院眼科

Regulatory mechanism and research progress of connective tissue growth factor in diabetic retinopathy

Xi-Da Liang, Guang Wang, Xiao-Long Chen

Department of Ophthalmology,Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Correspondence to:Xiao-Long Chen. Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. chenxl@sj-hospital.org

Received：2015-12-23Accepted：2016-03-07

Abstract

•Diabetic retinopathy is one of the microvascular abnormal diseases. In the late stage of disease progression, the antibody of vascular endothelial growth factor can significantly inhibit the formation of new blood vessels and improve macular edema, which is widely used in clinical. However, the aggravation of pro-fibrotic influence after long-term treated by the medicine also attracts a wide range of attention. Connective tissue growth factor, as an important cytokine in intraocular fibrosis, over expressed after treated by the drug, is considered to be one of the most important factors in the side effect of the drug, and is also a potential therapeutic target. After finishing the current research, the regulation mechanism of connective tissue growth factor, includes two ways, regulation of gene expression and direct binding to other cell factors or receptors. Because of its special four module structure, it has many kinds of cell factor specific binding sites, and its regulation mode is more dependent on the latter, which promotes or inhibits the expression of several important cytokine pathways. In diabetic retinopathy, its expression goes throughout the disease process. The accumulation of connective tissue growth factor plays an important role in promoting the thickening of basement membrane and the formation of new blood vessels in the early stage of the clinical stage and the formation of the new blood vessels. In this paper, the regulatory mechanism of connective tissue growth factor and the research progress of this factor in DR are systematically expounded.

KEYWORDS:•connective tissue growth factor;diabetic retinopathy

Citation:Liang XD, Wang G, Chen XL. Regulatory mechanism and research progress of connective tissue growth factor in diabetic retinopathy.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):673-677

摘要

糖尿病视网膜病变是一种微血管循环异常的致盲性眼病。在疾病进展后期，血管内皮生长因子抗体类药物因可显著抑制新生血管形成和改善黄斑水肿而被广泛应用于临床。然而，药物应用后纤维化趋势的加重也引起了广泛的关注。结缔组织生长因子作为眼内纤维化的重要细胞因子，在药物应用后过量表达，被认为是引起上述副反应的重要因素之一，也是一种潜在的辅助治疗靶点。整理目前研究进展后发现，结缔组织生长因子的调控机制包括调控下游细胞因子基因表达和直接结合于其他细胞因子或受体两种方式。因其特殊的四模块结构上具有多种细胞因子特异结合位点，其调控方式多依赖于后者，进而促进或抑制了多种重要细胞因子通路的表达。在糖尿病视网膜病变中，其表达贯穿整个疾病进程。在临床前期和新生血管形成末期，结缔组织生长因子的累积分别起到促进基底膜增厚和新生血管纤维化形成的重要作用。本文将对结缔组织生长因子多样化的调控机制及该因子在DR中的研究进展进行系统阐述。

关键词：结缔组织生长因子；糖尿病视网膜病变

引用：梁曦达，王光，陈晓隆.结缔组织生长因子在糖尿病视网膜病变中的调控机制及研究进展.国际眼科杂志2016;16(4):673-677

0引言

糖尿病视网膜病变(dibetic retinopathy, DR)是一种严重糖尿病微血管并发症。据一项2015年的调查显示，我国DR的发病率达1.8%/人年[1]。最新的流行病学调查显示，高血糖和基因遗传是较高血压和异常脂类代谢相比更为重要的两项DR危险因素[2]。其致病机制主要包括：(1)多元醇代谢通路异常；(2)晚期糖基化终产物形成；(3)蛋白激酶C的激活;(4)活性氧的产生；(5)遗传因素[3]。在高糖和组织缺氧状态下，视网膜微血管扩张，血-视网膜屏障被破坏，新生血管形成，视网膜前纤维血管膜的形成，最终造成牵拉性视网膜脱离。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)作为眼内纤维化的重要始动及调节因子，在DR的基底膜增厚，周细胞凋亡与迁移，肌成纤维细胞的过量聚集和细胞外基质的堆积和重构等多项病理改变中均有参与。

1 CTGF分子结构及调控机制

1.1 CTGF/CCN家族结构CCN家族的提出始于1990年代末期，最初其表达的蛋白被归于早期基因的产物或生长因子。最早发现的成员包括富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61, Cyr61)，CTGF，肾母细胞过度表达基因(nephroblastoma-overexpressed, NOV)。其生物学作用覆盖发育分化，血管生成，组织纤维化，炎性作用，肿瘤生长等多个领域[4]。其中，CTGF又名CCN2，是一种可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积的生长因子，在成人心血管、脑、胎盘、皮肤、肾、肝、肺及胰腺等多种组织中均有表达, 其中以肾脏组织中含量最为丰富[5]。目前发现的CCN家族成员包含Cyr61、CTGF、NOV、CCN4、CCN5、CCN6。除CCN5缺失部分模块外，其余家族成员均具有特征性四模块结构。CCN家族成员由胰岛素样生长因子结合区(IGFBP)和Von Wille因子C型重复区(VWC)，血小板反应蛋白I型重复区(TSP-1)和生长因子半胱氨酸群(CT)四个模块组成。每个模块都具有其独特的结合位点，中间由铰链区域连接，两侧各有两个模块，称之为“-NH2末端”和“-COOH末端”。在金属基质蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs)的水解作用下，CTGF的铰链结构断裂，分解为CTGF-N末端和CTGF-C末端，而弹性蛋白酶和血纤维蛋白溶酶可使CTGF水解为四个独立片段[6-8]。

1.2 CTGF/TGF-β通路转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)是CTGF最为人熟知的上游细胞因子，其通过丝裂原活化蛋白激酶等多个通路诱导CTGF的表达，共同诱导细胞外基质的产生[9]。不仅如此，TGF-β与CTGF还具有直接作用关系。研究人员在CTGF的VWC模块发现了TGF-β1和骨成型蛋白质-4(bone morphogenetic protein-4, BMP-4)的结合位点。CTGF与TGF-β1的结合不会抑制TGF-β1/TGF-β受体(TGF-β1/TGF-βR)通路，反而会促进TGF-β1与受体结合及下游因子的表达。值得注意的是，CTGF与TGF-β1的结合亲和力较低，且CTGF激活TGF-β1通路有若干条件限制，如受体和细胞膜结合，Smad2磷酸化，基因表达活化等。然而，CTGF的VWC模块与BMP4结合后，可减少BMP4与BMP4同源受体的结合来抑制BMP4信号通路。这种效应可被BMP2和TGF-β1竞争性抑制[10]。

纤连蛋白选择性剪接区域A(fibronectin- extra domain A，FN-EDA)是纤维连接蛋白mRNA的选择性剪接区域发生保留性剪接产生，在血管内皮细胞向间质细胞转化中起到重要作用。人们在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)中发现完整CTGF和CTGF-N末端均可辅助TGF-β2/TGFβRII对FN-EDA的激活作用，使其表达增加，但两者均不能直接激活FN-EDA的表达。TGF-β2可与CTGF-N末端结合验证了这一结论。而CTGF-C末端可与TGFβRII结合，在给予CTGF-N单克隆抗体后，CTGF-C的过表达可抑制TGF-β2对FN-EDA的促进作用，可能与CTGF-C末端竞争性抑制TGFβRII有关。另外，大量激活的FN-EDA可促进MMPs的产生，进一步促进了CTGF水解为CTGF-N末端和CTGF-C末端[11]。

1.3 CTGF与MMPsMMPs是一类锌指肽链内切酶，在细胞外基质的蛋白多糖、胶原蛋白等大分子的生理反转和病理降解中有关键作用。不仅如此，MMPs的底物还可以是细胞因子，如CTGF、单核细胞趋化蛋白-3(monocyte chemoattractant protein-3,MCP-3)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、Fas配体和胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP-3)等。其中，MMP-1，-2，-3，-7，-9，-13均可作用于CTGF的铰链区，使之水解断裂为CTGF-N末端和CTGF-C末端[12]。在MMPs水解CTGF后，对于CTGF-C末端是否会继续降解存在争议。早在1998年，人们就在血清、脑脊液和腹水中观察到了CTGF降解产物，大小为32、24、18kD[13]。体外实验中发现，-COOH末端约为10kD，激活了成纤维细胞和平滑肌细胞中的DNA合成。但在MMPs水解后的产物中，未发现类似CTGF-C末端产物，可能此过程中还有其他蛋白酶类参与CTGF-C末端的形成和降解过程[14]。

除水解作用外，CTGF与MMPs还具有相互调控机制。在软骨细胞中 CCN2可诱导MMP-9和MMP-13的表达[15]。研究者还发现CCN2通过肿瘤抑制基因p53促进MMP2基因的转录活性来参与视网膜新生血管形成[16]。不仅如此，在细胞外基质重构中发挥作用的MMP-3，最近被发现可入细胞核，直接调控CTGF的转录过程，从而促进CTGF和其mRNA的表达[17]。

1.4 CTGF与VEGF在组织的损伤和修复中，新生血管的形成和纤维化的形成是愈合的两个阶段。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和CTGF，作为各自的关键细胞因子，两者间的相互作用机制较为复杂。在增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)等多种疾病中，CTGF和VEGF的表达均升高，但两者浓度无明显相关性[18]。在细胞实验中，CTGF可以被VEGF-A诱导产生[19]。在大鼠实验中，给予糖尿病大鼠CTGF mi-RNA治疗后，CTGF mRNA和CTGF蛋白的浓度均显著下降，但纤连蛋白和VEGF mRNA水平并无影响。这似乎暗示了CTGF可能为VEGF的下游细胞因子[20]。然而研究显示，CTGF的表达与VEGF，TGF-β，视网膜细胞凋亡有密切相关。且CTGF的过表达发生于8～10wk,早于VEGF和TGF-β的12wk[21-22]。这提示CTGF应该有除VEGF和TGF-β之外更早出现的启动因子。

与TGF-β、BMP-4结合机制相似，VEGF也被发现了与CTGF的结合位点。CTGF与VEGF的结合位点位于TSP-1模块[9]，研究发现CTGF可与VEGF165结合，形成CTGF-VEGF165复合体，进而抑制VEGF165的活性表达。与此同时，MMPs可水解CTGF-VEGF165复合体[12]。VEGF可被胰蛋白酶降解，但对MMPs家族的水解作用不敏感。因此推测，MMPs通过水解CTGF-VEGF复合体，恢复了VEGF的活性[23]。

在DR中，VEGF抗体使用后CTGF的含量引发了关注。有文献认为，在疾病早期，VEGF抗体的使用可以减少CTGF的表达。而在PDR期，有研究显示VEGF抗体的临床应用可以在抑制VEGF的含量同时增加CTGF的含量，而CTGF-shRNA的应用可以同时抑制CTGF和VEGF的含量[22,24]。最新研究还发现，VEGF-A过度表达的CTGF通过铰链区与甲酰肽样受体-1(formyl peptide receptor-like,FPRL1)结合，促进了VEGF的新生血管形成作用[25]。

总之，CTGF可被VEGF-A诱导产生，过度表达的CTGF既可通过与FPRL1的结合，促进VEGF的新生血管形成作用，也可通过与VEGF-165的结合抑制VEGF的表达活性，该效应可被MMPs削弱。但目前尚未发现CTGF在基因表达层面对VEGF表达的抑制作用。另外，在PDR期，VEGF抗体的使用可显著增加CTGF的含量，这种现象可能由于CTGF-VEGF165复合体在VEGF抗体作用下的分离。

2 DR中的CTGF

2.1 临床前期及非增殖期改变DR的早期改变可出现在临床症状之前，包括毛细血管基底膜的增厚，周细胞的损伤和无细胞毛细血管的形成。多项研究认为，基底膜增厚是DR早期的特征性改变，且周细胞的损伤和无细胞毛细血管的形成都与之相关。CTGF的表达是毛细血管基底膜增厚的重要诱导因子，抑制CTGF的表达可减少周细胞的损伤和无细胞毛细血管的形成，延缓了DR中毛细血管基底膜的增厚变化[26]。TGF-β通路通过上调血浆酶原激活酶抑制因子-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)，Smad7和纤连蛋白等下游靶基因的表达，在临床前期DR的毛细血管基底膜增厚中起重要作用。TGF-β的表达主要活跃在视网膜内皮细胞和周细胞中，且CTGF mRNA在周细胞中亦有表达[27]。这一结果提示，CTGF在基底膜增厚中的作用可能与上文所述的CTGF/TGF-β协同作用机制有关。

CTGF在DR早期周细胞损伤中作用被多项研究证实。一些研究者认为，CTGF和视网膜细胞凋亡指数正相关，和周细胞减少比例正相关。且CTGF的表达早于微循环和周细胞数目的改变[28]。在大鼠周细胞中，CTGF和CCN1存在抗周细胞黏附和促周细胞凋亡的活性。另外，磷酸酶抑制剂可反转上述作用，说明CTGF和CCN1的作用可能与去磷酸化相关[29]。

2.2新生血管形成期CTGF作为重要促纤维化形成因子，在DR患者新生血管形成过程中表达显著提高，但其是否参与新生血管的形成过程至今仍有争议。在体外实验中，Kita等[18]认为CTGF与牛视网膜内皮细胞的增殖，迁移及孵化于真皮成纤维细胞的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的体外血管形成过程无关。然而，Shimo等[30]和He等[31]的结果都提示CTGF虽不直接促进HUVECs和脉络膜内皮细胞的增殖，却可调控HUVECs的迁移和体外管腔形成。 Lee等[25]发现了CTGF在VEGF-A调节新生血管形成中的协同作用。在HUVECs中，VEGF-A可与细胞膜上VEGFR直接结合，促进HUVECs的增殖、迁移和血管结构形成过程。与此同时，VEGF-A诱导的过度表达的CTGF可通过铰链区与FPRL1的结合，激活了细胞外信号调节激酶、磷酸化和细胞内钙离子浓度，进一步促进了HUVECs的迁移和血管结构形成过程。另外，MMP-2可通过激活p53相关基因促进CTGF表达，且在新生血管形成早期的基底膜降解，细胞外基质异常堆积等改变中作用显著[16]。

2.3纤维血管膜形成期CTGF在纤维化形成过程中有重要推动和调节作用[32]。特定的上游因子激活CTGF的初始表达后，过度表达的CTGF与TGF-β等通路的共同作用，促进细胞外基质重构因子的表达，其中包括大量胶原蛋白。在重建过程中，α-平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞(α-smooth muscle actin myofibroblasts，α-SMA myofibroblasts)可以通过自分泌机制产生CTGF，同时α-SMA阳性肌成纤维细胞也是纤维化进程的核心细胞介质[6]。

在对PDR患者的视网膜前纤维血管膜免疫组化实验中发现其中聚集了大量的肌成纤维细胞。CTGF在PDR患者纤维血管膜中的表达主要集中于血管内皮细胞和肌成纤维细胞，并通过局部旁分泌和自分泌途径调节血管新生-纤维化过程[33-34]。深入研究发现，在PDR患者眼内，血管内皮细胞和循环纤维细胞可转化为肌成纤维细胞，并参与病理性纤维化的形成。CTGF在血管内皮细胞向α-SMA阳性肌成纤维细胞转化时所起到重要推动作用[35]。

在PDR患者视网膜纤维血管膜中，CTGF-N末端在活跃的PDR患者和DR伴玻璃体出血患者中大量表达，多于非糖尿病患者，完整CTGF在各组中相同，CTGF-C末端低于可检测阈值。且CTGF-N末端多位于SMA活化肌成纤维细胞中[36]。

纤维血管膜是PDR患者视网膜新生血管的最终形式，但新生血管向纤维增殖膜转换的时机和调控机制一直未被发现。在PDR终末期，VEGF随纤维化的逐渐发展浓度降低，而CTGF与纤维化程度明显相关[37]。随后提出，CTGF/VEGF和CTGF值是评估视网膜纤维化程度最强预测指标[38]。这项结论还需要进一步研究给予理论支撑和临床证实。

3其他CCN家族因子的功能及与DR的关系

3.1 Cyr61Cyr61与CTGF具有相似的结构，经常两者共同出现参与细胞黏附、细胞增殖、新生血管形成等。Cyr61是血管生长和正常血管结构形成的重要因子。CTGF具有促纤维化形成倾向，而Cyr61似乎倾向于纤维化的消融。有研究者认为Cyr61与VEGF共同调控了CCN2因过度表达出现的纤维化倾向[37]。

Cyr61在DR中的作用尚不明确。可以确定的是Cyr61是高糖和晚期糖基化终产物的下游因子[29，39]。Cyr61在炎症和缺氧状态下可转变为加固状态或称翻译后缩短状态，这种缩短状态的Cyr61生物活性与原Cyr61蛋白不同，并且可能是Cyr61在疾病条件下的表达状态，因此这种缩短状态的Cyr61可能与PDR相关[40]。

3.2 NOVNOV作为目前CCN家族中唯一可以与CTGF形成二聚体的家族成员，两者具有直接作用关系。在软骨细胞和滑液细胞中，多研究证实NOV拮抗了CTGF在成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用。眼内是否存在相似机制需要进一步的实验发现[6]。

4结语

CTGF，最初以细胞生长因子的身份为人熟知，但人们一直未发现其特异细胞膜受体。其对于周细胞衰老和迁移、基底膜增厚、肌成纤维细胞的聚集和细胞外基质的堆积和重构等作用多通过与其他细胞因子在其四个模块上的特异性结合，促进或抑制该基因通路的表达来实现。CTGF基因敲除的小鼠不能存活，说明其在皮肤、血管、肝脾等多器官发育中作用不可或缺。但在生理状态下，CTGF含量常在可检测阈值以下。而在病理环境中，CTGF含量变化显著，似乎可以成为一种机体的异常信号。CTGF被MMPs水解后，CTGF-N末端和CTGF-C末端各自扮演了与完整CTGF不同的角色。有文献认为，CTGF-N末端作用于胶原蛋白系统的分化，而CTGF-C末端作用于DNA合成和细胞增殖[8]。在增殖期DR中，玻璃体腔CTGF-C末端未被检测出，有研究发现其能与TGF-β2受体特异性结合，在CTGF-N末端抗体的应用下对TGF-β2通路起抑制作用[11]，其去向需要进一步研究证实。

CTGF的表达与DR的发生发展关系密切。在DR临床前期，CTGF的异常表达可能为疾病的发生起到重要的提示预警作用。但由于眼内CTGF含量与血液CTGF含量未见明显相关性，眼内CTGF浓度的简易、低廉的检测手段有待进一步发现。在PDR期，CTGF的眼内浓度与眼内纤维增殖程度具有一定相关性。CTGF的浓度可于玻璃体切割术中取样检测，为术后并发牵拉性视网膜脱离提供一定的风险评估。以上设想尚需进一步的理论证实和临床检测技术支持。在增殖期DR末期，VEGF的浓度呈下降趋势，这可能与CTGF的不断表达并与VEGF结合并抑制其活性有关。而应用VEGF抗体后，VEGF-CTGF复合体的解离或可解释CTGF在玻璃体腔浓度的增加，并成为纤维化趋势的重要原因。同时，CTGF的家族成员多与CTGF相互作用，共同调节纤维化进程。对于DR中，新生血管-纤维化的调控开关能否被CTGF抑制剂逆转尚需要深入研究予以验证和发现。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.21

收稿日期：2015-12-23 修回日期： 2016-03-07

通讯作者：陈晓隆，博士，主任医师，教授，博士研究生导师，研究方向：眼底病、眼外伤.chenxl@sj-hospital.org

作者简介：梁曦达，男，在读硕士研究生，研究方向:眼底病。