vWF及ADAMTS13在肝脏疾病中的意义

陈亚利　许姗姗　张晶

100069　首都医科大学附属北京佑安医院



·综述·

vWF及ADAMTS13在肝脏疾病中的意义

陈亚利许姗姗张晶

100069首都医科大学附属北京佑安医院

微循环障碍参与了多种疾病的进展，例如脓毒症、多器官衰竭等。血管性假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)可使血小板粘附聚集于血管内皮细胞，导致血小板血栓形成；血管性血友病因子特异性裂解酶(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombo-spondin type I repeats 13，ADAMTS13)可裂解vWF多聚体，预防血栓形成， vWF:Ag / ADAMTS13活性比值升高常常导致微循环障碍，同时也是微循环障碍和微血栓形成的主要血清学标记物。近期研究表明肝脏疾病也存在微循环障碍，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值显著异常。现对vWF:Ag / ADAMTS13活性比值与在肝脏疾病的意义及其影响因素综述如下。

一、vWF和ADAMTS13 简介

正常情况下，vWF主要由血管内皮细胞产生，但肝损伤时，肝窦内皮细胞也可表达vWF，并促进局部凝血过程，为最具特征性的内皮细胞损伤标记物。vWF能够与血小板膜GPⅠb-Ⅸ复合物及内皮下胶原结合，介导血小板在血管损伤部位的黏附；与GPⅡb-Ⅲa结合，参与血小板的聚集过程；稳定Ⅷ因子，促进凝血过程。vWF以UL-vWF(ultralarge vWF，即vWF多聚体)形式储存和释放，UL-vWF促进血小板粘附的能力最强。ADAMTS13是一种主要由肝星状细胞合成和分泌的金属蛋白酶，能在伸展的UL-vWF上的A2区切断1605酪氨酸和1606蛋氨酸之间的肽键, 将其裂解为相对分子量为176 000 和 140 000大小的两个片段，防止UL-vWF过度形成[1]。当ADAMTS13的活性减弱而不能切断UL-vWF，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值升高，导致血小板聚集形成血小板血栓，进而引起微循环障碍[2-6]。

vWF抗原水平可利用免疫电泳法、ELISA或胶乳凝集散射比浊法对血浆进行准确定量，应用最多的是ELISA方法。血浆中的ADAMTS13抗原水平检测可采用ELISA方法，但是检测其活性更有意义。第一代方法是检测其裂解产物或者间接的检测其胶原结合活性及瑞斯托菌素聚合活性。这种方法非常耗时，通常用于科学研究[7]。从1999年起，Furlan等人采用vWF多聚体的琼脂糖凝胶电泳法(Furlan改良法)，此方法的可重复性高，但是也很耗时，通常需要几天时间[2，8]。最新的方法是间接法与直接法联合，此法可仅耗时数小时，并且具有更高的精确度和敏感性(可检测出1%～3%的ADAMTS13的活性)、可重复性好，并且相当省时[7，9]，是目前普遍采用的检测方法。

二、vWF和ADAMTS13 与脓毒血症微循环障碍和多器官功能衰竭的关系

脓毒血症导致的微循环障碍和多器官衰竭(mul-tiple organ failure，MOF)是导致患者死亡的主要原因，其机制研究的最透彻。Clau RA等[10]研究表明，全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者血浆vWF抗原水平随着SIRS严重程度的增加而增加，ADAMTS13的活性也相应下降，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值显著升高。Bockmeyer CL[11]等发现，心肺体外循环伴有严重脓毒血症患者他们也发现了随着炎症反应的加重，ADAMTS13活性逐步下降；二者比例的显著失衡与UL-vWF的出现、器官障碍和病死率有关，继而推测SIRS导致ADAMTS13下降，这激活了凝血系统，进而导致MOF。其它大量研究结论与之相似，即vWF:Ag / ADAMTS13活性比值通过微循环障碍参与了脓毒血症多脏衰的发生发展[12，13]。

三、vWF和ADAMTS13 在肝病中的临床意义

(一)病毒性肝炎及肝硬化Uemura M等[14]对慢性病毒性肝病研究表明，ADAMTS13活性随肝功能减退呈现下降趋势：在慢性肝炎、肝硬化从Child A级到C级随病情进展呈降低趋势：在慢性肝炎组为87%，肝硬化Child A、B、C级分别为79%、63%和31%，其中5例终末期肝硬化甚至小于3%。vWF抗原则随着肝功能下降呈现升高的趋势：慢性肝炎患者vWF水平较健康人增加2.5倍，肝硬化约增加3～5倍，个别Child C级患者高达10倍。vWF:Ag/ADAMTS13活性比值在健康人为1.0，在肝硬化ChildA患者为1.6，Child B 级为5.0，Child C级为16.8。另一项研究表明[14]，16%的肝硬化患者检测到UL-vWF，这些患者ADAMTS13活性更低，CTP评分、肌酐和血氨更高。以上研究表明，随着肝病的加重，肝脏微循环障碍逐渐加重，这可能参与了肝硬化及肝功能衰竭的发展。

(二)酒精性肝病酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)，尤其重症酒精性肝炎(severe alcoholic hepatitis，SAH)常合并肝性脑病、肺炎、急性肾功能不全、消化道出血等多脏器功能不全，病死率极高。Matsuyama T等[15]研究发现：ADAMTS13活性在肝硬化、AH和SAH中逐渐下降，分别为76%、62%和性 24%；vWF:Ag水平则显著升高，分别为514%，405%和806%(对照组为100%)；vWF:Ag / ADAMTS13活性比值分别为8.6、8.9和102.2(对照组为1.0)。3例死于MOF的SAH患者中，ADAMTS13活性均低于16%, vWF:Ag 则高达560%以上，vWF:Ag / ADAMTS13活性比值显著升高，最高者达到240.4。在SAH和AH恢复期，ADAMTS13活性和vWF:Ag水平恢复正常，而死亡患者则没有明显变化。该研究表明vWF:Ag / ADAMTS13活性不仅通过诱导微循环障碍参与了酒精性肝炎和多器官衰竭的发生和发展，而且可以作为一个预后指标。Uemura的研究结果与之相似[16]。

(三)肝衰竭Hugenholtz GC等[17]研究了50例急性肝损伤和急性肝衰竭患者，结果也发现这些vWF:Ag / ADAMTS13活性比值较正常对照组显著升高，并且患者血浆在体外能够显著促进血小板聚集。ADAMTS13活性降低的患者更容易并发肝性脑病，其肝移植率和病死率更高，因而推测vWF:Ag / ADAMTS13活性比值的严重失衡促进了肝衰竭患者发生多器官功能衰竭。

四、vWF和ADAMTS13水平的影响因素

(一)vWF合成增多的原因

1. 内皮细胞功能受损vWF是内皮细胞受损的标记物，肝病时由于肝功能减退及各种因素导致多种血管活性因子失调，形成心输出量增加、低外周血管阻力的高动力循环状态，造成血流动力学改变；肠道屏障功能受损导致内毒素吸收入血，也可以导致血管内皮功能受损，进而导致vWF释放增多。

2. 炎症因素Bernardo A等[18]研究了炎症因子对UL-vWF形成的影响，并评估了炎症与血栓形成的关系。分别应用IL-6-sIL-6R、组胺、IL-8及TNF-α孵育人脐静脉内皮细胞，上清液中UL-vWF水平分别为(12.6±4.4)，(66.0±29.7)，(47.1±11.5)和(59.6±14.9)(P<0.01)，并具有剂量依赖性。然后，采用不同浓度的IL-6、IL-8和TNF-α孵育ADAMTS13预处理的富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，结果发现ADAMTS13 孵育的PRP，上清液中无法检测到UL-vWF；IL-6处理组导致ADAMTS13 活性降低，从而抑制了UL-vWF 裂解高达50%(P<0.01)，而IL-8和TNFα处理组不能检测到UL-vWF，说明其对ADAMTS13活性没有影响。这些结果表明，炎性细胞因子可能刺激UL-vWF释放(如IL-8和TNF-α)和UL-vWF裂解(如IL-6)，导致UL-vWF血浆中累积并黏附于内皮的细胞，从而揭示了炎症导致血栓形成的机制。Ferro D.等[19]研究发现vWF抗原水平与内毒素血症强相关(r=0.92;P=0.0001)，并且经过治疗内毒素血症好转后，vWF水平也下降；人脐静脉内皮细胞在体外用 125 pg/mL～500 pg/mL内毒素培养时，内皮细胞以剂量依赖的方式释放vWF；Schorer AE等[20]采用IL-1和LPS孵育内皮细胞1～2 h，上清液中vWF显著增加，但内皮细胞中vWF却下降，表明只是二者仅诱导其释放，但合成并未增加。由此可见肝硬化时内毒素血症是导致内皮细胞损伤的机制之一。

(二)ADAMTS13含量变化的原因

1. 肝脏合成ADAMTS13减少如前所述，ADAMTS13主要是由HSC合成，其他细胞如血小板、血管内皮细胞、肾系膜细胞虽然也能够合成，但是合成量很少。Kume Y 等[21]报道HSC凋亡在ADAMTS13活性降低中发挥重要作用。用二甲基二硝铵(dimethylnitrosamine，DMN)诱导大鼠HSC凋亡，导致血浆中ADAMTS13活性显著降低(用50 mg/kg体质量的DMN可使其降至正常对照的40%，P<0.05)；但用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCL4)或硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)处理的大鼠没有发生HSC凋亡，血浆ADAMTS13活性也没有显著降低。还发现在70%肝切除的大鼠中，其HSC缺失，血浆ADAMTS13活性也降低。这均表明，HSC数量可能是影响ADAMTS13水平的因素之一。

2. ADAMTS13消耗增加在很多肝病中，vWF合成增多，处理过量的VWF抗原导致ADAMTS13的消耗增多，这也是肝病时ADAMTS13含量减低的重要原因之一[14-16，22]。

3. 炎症因子与ADAMTS13的关系Uemura M等[14]研究了肝硬化患者血浆中部分炎症因子的含量变化，发现 Child C级肝硬化患者中ADAMTS13活性最低，血浆IL-6浓度最高，在合并感染的肝硬化患者中更加显著。Matsuyama T[15，16]发现，AH患者，特别是SAH患者TNF-α、IL-8、IL-6显著升高；ADAMTS13活性与这些炎症因子存在相关性，提示高炎症因子血症可能是导致血浆ADAMTS13活性降低的原因之一。

4. 内毒素抑制血浆ADAMTS13活性Reiter RA等[23]给10名男性志愿者静脉注射2 ng/kg体质量的内毒素，ADAMTS13活性在4 h后(用胶原结合活性法测量)降低到基线的 (64±5)% ，(P<0.001), 24 h后仍未完全恢复(86±6)%，(P=0.008)，7 d后恢复正常。而安慰剂组各指标无显著变化。

5. 血浆抑制物引起血浆ADAMTS13活性降低Uemura M等[14]发现在83%的中度至重度ADAMTS13活性缺乏的失代偿期肝硬化患者血浆中检测到了ADAMTS13的抑制物，其水平浓度波动于0.5～1.0 BU/mL。此外，在5例终末期肝硬化病人的血浆中用WB的方法检测到了ADAMTS13的IgG型特异性抗体，并且其ADAMTS13活性极度降低，小于正常对照组的3%。在这5例患者中，有2例为丙肝患者，乙肝、原发性胆汁性肝硬化及隐源性肝硬化患者各1例，推测丙肝患者存在的多种非器官特异性抗体中可能包括ADAMTS13特异性抗体[24-26]。

(三)影响vWF 和ADAMTS13的其他可能机制

在其他多种疾病中，对vWF 和ADAMTS13的变化也进行了很多的研究，但是在肝病中还没有证实。例如，Ono T等[27]在脓毒血症诱导的DIC中发现ADAMTS13抗原降低，并且可检测到ADAMTS13降解产物，表明ADAMTS13下降与其降解酶有关，而不仅仅是肝脏合成减少；Djamiatun K等[28]在研究重度登革热时发现，内皮细胞损伤导致WPB小体(Weibel-Palade bodies)胞吐作用增强，可以导致的循环中vWF增多；De Filippis V等[29]在研究慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)时发现大于10%的透析患者其vWF的Met1606位点氧化，导致UL-vWF积累，进而聚集并激活了血小板，并且与细菌结合更牢固，导致了CKD患者的血栓进展及脓毒血症的发生，由此得出结论vWF的Met1606位点氧化是慢性肾功能衰竭和脓毒血症性血栓并发症的危险因素。

五、展望

尽管在脓毒血症等多种危重疾病中关于二者含量变化的机制有很多研究，但在肝病中相应研究还比较匮乏。目前有许多研究表明二者含量变化通过微循环障碍参与了重症肝病的进展，但也有相反意见。然而，几乎所有研究都提示二者含量及活性变化与重症肝病的不良预后密切相关。改善微循环是否能够改善肝病的预后，还需要进一步的研究。

参考文献

1 Moake J L, Turner N A, Stathopoulos N A, et al. Involvement of large plasma von Willebrand factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. Clin Invest, 1986,78:1456-1461.

2 Furlan M, Robles R, Lammle B. Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood, 1996,87:4223-4234.

3 Dong J F, Moake J L, Bernardo A, et al. ADAMTS-13 metalloprotease interacts with the endothelial cell-derived ultra-large von Willebrand factor. Biol Chem, 2003,278:29633-29639.

4 Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, et al. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood, 2001,98:1662-1666.

5 Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, et al. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood, 2001,98:1654-1661.

6 Levy G G, Nichols W C, Lian E C, et al. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature, 2001,413:488-494.

7 Just S. Methodologies and clinical utility of ADAMTS-13 activity testing. Semin Thromb Hemost, 2010,36:82-90.

8 Sadler J E, Moake J L, Miyata T, et al. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology Am Soc Edu Program, 2004:407-423.

9 Tripodi A, Peyvandi F, Chantarangkul V, et al. Second international collaborative study evaluating performance characteristics of methods measuring the von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS-13). J Thromb Haemost, 2008,6:1534-1541.

10Claus R A, Bockmeyer C L, Budde U, et al. Variations in the ratio between von Willebrand factor and its cleaving protease during systemic inflammation and association with severity and prognosis of organ failure. Thromb Haemost, 2009,101:239-247.

11Bockmeyer C L, Claus R A, Budde U, et al. Inflammation-associated ADAMTS13 deficiency promotes formation of ultra-large von Willebrand factor. Haematologica, 2008,93:137-140.

12Martin K, Borgel D, Lerolle N, et al. Decreased ADAMTS-13 (A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeats) is associated with a poor prognosis in sepsis-induced organ failure. Crit Care Med, 2007,35:2375-2382.

13Nguyen T C, Liu A, Liu L, et al. Acquired ADAMTS-13 deficiency in pediatric patients with severe sepsis. Haematologica, 2007,92:121-124.

14Uemura M, Fujimura Y, Matsumoto M, et al. Comprehensive analysis of ADAMTS13 in patients with liver cirrhosis. Thromb Haemost, 2008,99:1019-1029.

15Matsuyama T, Uemura M, Ishikawa M, et al. Increased von Willebrand factor over decreased ADAMTS13 activity may contribute to the development of liver disturbance and multiorgan failure in patients with alcoholic hepatitis. Alcohol Clin Exp Res, 2007,31:S27-35.

16Uemura M, Matsuyama T, Ishikawa M, et al. Decreased activity of plasma ADAMTS13 may contribute to the development of liver disturbance and multiorgan failure in patients with alcoholic hepatitis. Alcohol Clin Exp Res, 2005,29:264S-271S.

17Hugenholtz GC, Adelmeijer J, Meijers JC, et al. An unbalance between von Willebrand factor and ADAMTS13 in acute liver failure: implications for hemostasis and clinical outcome. Hepatology, 2013,58:752-761.

18Bernardo A, Ball C, Nolasco L, et al. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood, 2004,104:100-106.

19Ferro D, Quintarelli C, Lattuada A, et al. High plasma levels of von Willebrand factor as a marker of endothelial perturbation in cirrhosis: relationship to endotoxemia. Hepatology, 1996,23:1377-1383.

20Schorer AE, Moldow CF, Rick M E. Interleukin 1 or endotoxin increases the release of von Willebrand factor from human endothelial cells. Br J Haematol, 1987,67:193-197.

21Kume Y, Ikeda H, Inoue M, et al. Hepatic stellate cell damage may lead to decreased plasma ADAMTS13 activity in rats. FEBS letters, 2007,581:1631-1634.

22Matsumoto M, Kawa K, Uemura M, et al. Prophylactic fresh frozen plasma may prevent development of hepatic VOD after stem cell transplantation via ADAMTS13-mediated restoration of von Willebrand factor plasma levels. Bone Marrow Transplant. 2007,40:251-259.

23Reiter RA, Varadi K, Turecek PL, et al. Changes in ADAMTS13 (von-Willebrand-factor-cleaving protease) activity after induced release of von Willebrand factor during acute systemic inflammation. Thromb Haemost, 2005,93:554-558.

24Clifford BD, Donahue D, Smith L, et al. High prevalence of serological markers of autoimmunity in patients with chronic hepatitis C. Hepatology, 1995,21:613-619.

25Hsieh MY, Dai CY, Lee LP, et al. Antinuclear antibody is associated with a more advanced fibrosis and lower RNA levels of hepatitis C virus in patients with chronic hepatitis C. J Clin Pathol, 2008,61:333-337.

26Lenzi M, Bellentani S, Saccoccio G, et al. Prevalence of non-organ-specific autoantibodies and chronic liver disease in the general population: a nested case-control study of the Dionysos cohort. Gut, 1999,45:435-441.

27Ono T, Mimuro J, Madoiwa S, et al. Severe secondary deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13) in patients with sepsis-induced disseminated intravascular coagulation: its correlation with development of renal failure. Blood, 2006,107:528-534.

28Djamiatun K, van der Ven AJ, de Groot PG, et al. Severe dengue is associated with consumption of von Willebrand factor and its cleaving enzyme ADAMTS-13. PLoS Negl Trop Dis, 2012,6:e1628.

29De Filippis V, Lancellotti S, Maset F, et al. Oxidation of Met1606 in von Willebrand factor is a risk factor for thrombotic and septic complications in chronic renal failure. Biochem J, 2012,442:423-432.

(本文编辑：张苗)

(收稿日期：2015-09-05)

通信作者：张晶，Email：drzhangjing@163.com

基金项目：基于数据挖掘的重型肝炎预后判断治疗决策网络系统研究(No. KM2013100250 08)；基于数据挖掘技术的重型肝炎肝衰竭预后判断模型及治疗决策网络系统的研究(No.CIT&TCD201304178)