靶向肝星状细胞的基因治疗逆转肝纤维化的研究进展

谌双君 赵卫华 丛敏



靶向肝星状细胞的基因治疗逆转肝纤维化的研究进展

谌双君 赵卫华 丛敏

作者单位：100050 首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心，肝硬化转化医学北京市重点实验室，国家消化系统疾病临床医学研究中心

肝纤维化由肝脏受到慢性损伤后细胞外基质的过度沉积引起，激活的肝星状细胞（HSCs）是细胞外基质的主要来源。肝纤维化是许多慢性肝脏疾病的共同病理基础与特征，包括病毒性和自身免疫性肝炎，铁沉积，酒精性肝病和胆汁淤积等。目前认为肝脏细胞外基质的合成与降解失衡，导致其在肝内过度沉积是肝纤维化发展的主要机制。肝损伤导致HSCs活化并失去其静止表型。活化的HSCs具有肌成纤维细胞样表型，细胞骨架蛋白表达上调如a-SMA，同时分泌大量胶原。HSCs是肝脏中主要的促纤维化细胞，是细胞外基质的主要来源［1，2］。肝纤维化如果不能得到及时治疗将会进展为肝硬化甚至肝细胞癌，并会出现一系列并发症如食管静脉曲张破裂出血、肝性脑病、腹水、肝肾综合征等，给患者带来巨大的痛苦甚至威胁生命［2］。为此，针对肝纤维化逆转，尤其是抑制HSCs活化或者诱导活化后HSCs凋亡的研究成为近年来研究的热点。由于，目前对肝纤维化逆转的研究主要是通过作用于HSCs，抑制其促纤维化基因的表达及诱导其凋亡等。现就近年来靶向肝星状细胞的基因治疗研究进展综述如下。

一、靶向阻断HSCs受体-配体的相互作用促进肝纤维化的逆转

（一）转化生长因子β1（TGFβ1）及其受体 肝纤维化过程中，HSCs被激活并且通过提高对可溶性介质的反应能力进行增殖，进而发挥促炎及促纤维化作用［3］。在这些可溶性介质中，TGFβ1是一个很重要的细胞因子，其通过Smad2/3信号通路促进HSCs的激活［3］。在纤维化动物模型及肝纤维化病人体内均可检测到TGFβ信号通路的增强［4］，因此，阻断TGFβ介导的这一信号通路对有效逆转肝纤维化具有重要意义。

有研究［3］发现通过微小RNA（miRNA）-101抑制TGFβ信号通路进而能够缓解肝纤维化。研究者通过建立四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝纤维化模型发现在肝纤维化进展过程中，肝组织、激活的星状细胞及受损的肝细胞miR-101表达水平显著降低；通过预防性给予以慢病毒为载体的miR-101可以显著减轻肝纤维化，而给予反义寡核苷酸抑制miR-101的表达后加重肝纤维化。此外，体外实验发现miR-101抑制活化星状细胞的增殖和迁移及活化标志物的表达，使星状细胞由活化状态转化为静止状态。究其机制，miR-101在肝纤维化形成过程中通过靶向作用于TGFβ1受体（TβRI）及其转录激活因子KLF6，进而抑制TGFβ信号通路，最终抑制促纤维化细胞因子的产生、肝细胞凋亡，促进肝纤维化的逆转。

此外，另有研究发现miR-30也在肝纤维化中参与TGFβ信号通路的调控。以腺病毒为载体诱导miR-30在CCl4肝纤维化小鼠模型中的表达，可以通过miR-30作用于转录因子KLF11进而抑制TGFβ信号通路［5］，最终显著降低肝纤维化程度。

因为系统性抑制TGFβ会诱发机体炎症反应或者导致上皮细胞增生甚至肿瘤的发生，因此靶向HSCs中的TGFβ信号通路可能是肝纤维化治疗中的一个潜在治疗靶点。

（二）神经受体 内源性大麻素（CB）家族起源于花生四烯酸，其通过与CB1和CB2受体结合，抑制免疫细胞的活化，维持辅助性T细胞（Th）1/Th2的平衡，进而发挥免疫调节作用［6］。近年来研究发现肝硬化病人肝内肌成纤维细胞CB1受体表达增加，并且小鼠肝纤维化模型及非酒精性脂肪性肝炎模型中肝脏肌成纤维细胞表达的CB1受体增高［7］。

有学者［8］通过构建以慢病毒为载体靶向作用于CB1受体的小干扰RNA（CB1-RNAi-LV）发现其在抑制大鼠原代HSCs 的CB1受体表达的同时可以显著抑制星状细胞的活化、增殖及细胞外基质的产生。此外，给予大鼠尾静脉注射CB1-RNAi-LV治疗，可以明显降低二甲基亚硝胺诱发的肝纤维化程度，大鼠肝脏间充质细胞标志物α-SMA，波形蛋白等表达水平均降低。此研究通过体外、体内实验证实了抑制星状细胞CB1受体的表达对肝纤维化具有抑制作用。

另有研究［9］发现外周选择性CB1受体拮抗剂VD60能显著抑制大鼠原代HSCs及人星状细胞系LX-2的增殖，使α2（I）前胶原MRNA表达水平显著降低。此外，VD60在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型体内具有抗纤维化活性。综上所述，抑制HSCs CB1受体已为肝纤维化的治疗提出新的思路。

（三）血管紧张素II1型（AT1）受体 血管紧张素II由星状细胞分泌，其可与1型受体结合，通过JAK2介导的信号通路发挥作用［10］。应用血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂或AT1受体阻滞剂（ARBs）阻断肾素-血管紧张素系统对临床肝纤维化的治疗可能有效。有研究［11］发现AT1与大麻素通过受体的异二聚体作用可以发挥协同作用。研究者通过运用免疫共沉淀、共振能量转移分析等方法发现AT1受体与CB（1）受体形成异二聚体，从酒精性饮食的大鼠肝脏内分离HSCs，发现其AT1 R-CB（1）R异聚体表达水平显著升高，血管紧张素II介导的信号通路表达增强。此外，阻断CB1受体的活性可以抑制血管紧张素II介导的促有丝分裂信号通路，使促纤维化基因表达降低。这为联合应用ARB和CB1受体阻断剂治疗肝纤维化提供了理论依据。

（四）酪氨酸蛋白激酶受体 许多增殖性细胞因子包括血小板源性生长因子（PDGF），成纤维细胞生长因子（FGF）及肿瘤坏死因子（TGF）-α信号通路通过酪氨酸蛋白激酶受体发挥作用。索拉非尼，是一种多种酪氨酸激酶受体抑制剂，可以靶向作用于PDGF受体及Raf/ERK信号通路，在动物模型中具有抗纤维化作用［12］。作为小分子酪氨酸激酶拮抗剂的伊马替尼，也具有抗纤维化的作用［13］。体外培养的HSCs给予甲磺酸伊马替尼处理后，其凋亡增加，增殖减少；CCl4小鼠肝纤维化模型给予甲磺酸伊马替尼治疗后可以缓解肝纤维化，促进肝再生［13］。

二、通过增强细胞外基质的降解促进肝纤维化的逆转

肝纤维化时ECM合成和降解失衡，从而导致ECM的过度沉积，其中ECM降解由MMPs介导，而MMPs的活动由金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）调节［14］。活化的HSCs除了I型胶原合成增加之外，TIMPs表达增加使ECM合成和降解失调并向合成增加的方向发展，引起组织纤维化［15］。TIMPs共有四种，在肝损伤中发挥作用的主要是TIMP-1［16］。许多研究发现TIMP-1不仅可以通过阻断MMPs的功能阻止ECM的降解，而且能抑制活化HSCs的凋亡［17］。因此，抑制TIMP-1的表达将有助于促进肝纤维化的逆转。

Cong等［18］通过构建以腺相关病毒为载体靶向作用于大鼠TIMP-1的小干扰RNA（rAAV/siRNA-TIMP-1）在抑制大鼠HSC-T6细胞系TIMP1基因的表达的同时可以使MMP-13表达增加。研究者又进一步证实了rAAV/siRNA-TIMP-1在大鼠肝纤维化模型中的作用。对CCl4和胆管结扎两种大鼠肝纤维化模型给予rAAV/siRNA-TIMP-1治疗发现能够显著减轻肝纤维化的程度，星状细胞激活标志物α-SMA及TGFβ1水平均显著降低，并且MMP13活性及表达水平显著升高。rAAV/siRNA-TIMP-1治疗通过直接提高MMP-13的表达及减少活化HSCs使细胞外基质降解增多，合成减少，进而减轻肝纤维化［19］。

目前认为，未充分交联的胶原更易被内源性胶原酶和其他酶所降解。研究发现与正常组织相比，小鼠纤维化肝组织中胶原交联酶赖氨酰氧化酶2（LOXL2）水平升高，对CCl4小鼠肝纤维化模型给予LOXL2单克隆抗体治疗可以缓解肝纤维化，并使其p-Smad3表达水平显著降低［20］。

因此抑制TIMP-1的表达或者封闭胶原纤维交联酶的作用可能是一种有效的抗纤维化治疗方法。

三、靶向作用于HSCs表达的蛋白促进肝纤维化的逆转

（一）金属硫蛋白（MT） MT是一种重要的锌离子结合型蛋白，与锌的代谢及稳态有关［21］，但近年来其在肝纤维化中的作用受到关注。

Jiang等［22］应用CCl4小鼠肝纤维化模型发现在肝纤维化进展期肝内MT表达水平降低，而在逆转期肝内MT表达水平升高。敲除小鼠MT基因给予CCl4四周停药后无纤维化的逆转，对不可逆转期肝纤维化模型及MT敲除肝纤维化模型小鼠给予以腺病毒为载体的人金属硫蛋白IIA（h MT-IIA）基因治疗可以使肝纤维化逆转，促进肝细胞再生，推测MT在肝纤维化逆转中发挥着重要作用。

Xu等［23］又进一步证实了h MT-IIA转染对人肝星状细胞中金属蛋白酶表达改变的影响作用。人星状细胞系LX-2在培养24小时后表达α-SMA、I型胶原增多，胶原酶表达水平降低，以质粒为载体将人MT-IIA基因转染入活化的HSCs可以使其MT蛋白水平升高并伴随α-SMA、I型胶原及其MRNA表达水平降低及金属蛋白酶（MMP）1，8，13表达水平的升高。这说明HSCs活化状态的逆转，尤其是胶原酶表达水平的上调可能参与MT基因治疗中肝纤维化的逆转，但是其机制尚需进一步研究。

（二）N-乙酰葡糖胺转移酶V（Gn T-V） 糖基化是真核细胞最常见的蛋白质翻译后修饰作用之一，由高尔基体糖基转移酶催化，因此糖基化异常主要由糖基转移酶表达异常引起［24］。N-乙酰葡糖胺转移酶V（Gn T-V）作为糖基转移酶的一种，其在肝纤维化中的作用近年来备受关注。

最近有学者［25］通过腹腔注射CCl4或硫代乙酰胺（TAA）诱导的小鼠肝纤维化模型，发现在肝纤维化形成过程中肝内Gn T-V显著升高。同时，激活的星状细胞及损伤的肝细胞中Gn T-V表达上调。对CCl4或硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝纤维化模型小鼠尾静脉注射以腺病毒为载体靶向作用于Gn T-V的小干扰RNA（Ad MS1）可以缓解纤维化。体外对HSC-T6转染Ad MS1，48-72小时后其促纤维化基因（I型胶原、αSMA、TIMP-1及波形蛋白）的表达水平显著降低。此外，敲除星状细胞中的Gn T-V基因可以减弱TGFβ/ Smad信号转导并抑制HSCs的活化，并且可以通过阻断PDGF/Erk信号通路进而抑制血小板源性生长因子介导的星状细胞扩增及迁移。

因此，Gn T-V参与毒素诱导的肝纤维化进程，靶向作用于Gn T-V可能是治疗肝纤维化的可行、有希望的方法。

四、刺激活化星状细胞的凋亡促进肝纤维化逆转

肌成纤维细胞的凋亡可以有效促进肝纤维化的逆转，其抗凋亡蛋白如Bcl-2及转录因子如NF-kB表达的增加［26］，可以促进HSCs的生存。在动物模型中证实，NF-kB抑制剂胶霉毒素能够促进肝纤维化的恢复，柳氮磺嘧啶与血管紧张素转化酶抑制剂也可通过抑制NF-kB信号通路来降低肌成纤维细胞生存率从而具有抗纤维化的作用［26］。

NK细胞能够清除活化的星状细胞，因此，通过促进NK细胞的增殖将会有助于减轻肝纤维化。NK细胞活化后产生的IFN-γ，也是NK细胞抗纤维化的重要机制之一。尽管体液输入IFN-γ在临床试验中并未取得满意的效果，研究者仍更多地关注着受体介导的靶向活化的HSCs的IFN-γ治疗方案［27］。

综上所述，通过靶向阻断HSCs受体-配体的相互作用、增强细胞外基质的降解、靶向作用于HSCs表达的纤维化相关蛋白及刺激活化星状细胞的凋亡，均可促进肝纤维化逆转。这些研究都为临床肝纤维化治疗提供了希望和思路。

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（本文编辑：冯珉）

·经验交流·

收稿日期：（2015-09-10）

通信作者：丛敏，Email：mao mao0623@sina.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81370544），北京市自然科学基金（7142043），王宝恩肝纤维化基金（CFHPC0120131）