果树体细胞胚胎发生影响因子研究进展

任海燕，薛晓芳，王永康，赵爱玲，隋串玲，李登科，丁国杰

专题综述

果树体细胞胚胎发生影响因子研究进展

任海燕1，薛晓芳1，王永康1，赵爱玲1，隋串玲1，李登科1，丁国杰2

(1山西省农业科学院果树研究所，山西 太原 030031；2山西省闻喜县农业委员会，山西 闻喜 043800)

从基因型、外植体、培养基、碳源、外源激素、添加物、培养条件等内外因素几个方面对果树体细胞胚胎发生的影响因子研究进展进行了综述，并探讨了存在的问题和今后的研究方向，为果树体细胞胚的研究提供参考。

果树；体细胞胚胎发生；内因；外因

植物体细胞胚胎发生发育与合子胚相似，是离体培养形态发生的有效途径[1]。自1958年，Steward等和Reinert报道了胡萝卜体细胞胚发生的研究后，人们在大量的植物组织培养、单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚的发生。目前我国涉及该研究的树种有数10个，已有100多种植物培育出了体细胞胚[2，3]，特别是在针叶树体细胞胚发生的生理代谢、形态结构特征以及基因表达研究等方面取得了较好成果[4]。近年来，关于果树体细胞胚发生的研究也越来越多，并已在苹果、核桃、枇杷、葡萄、荔枝、蓝莓、香蕉、草莓、枣、桃、柿等树种上成功获得体细胞胚[5]。

作为快速繁殖和制作人工种子的重要手段的植物体细胞胚发生技术，其再生植株的最初来源是单个胚性细胞，能够克服遗传嵌合及后代分离问题，对于进行基因工程或细胞工程育种有着重要意义。体细胞胚的发生有直接途径和间接途径。前者是外植体不经过愈伤组织阶段，直接诱导分化出来；后者是通过脱分化形成愈伤组织后，体细胞胚由胚性愈伤组织发育而来。体胚的发生受多种因素影响，包括基因型、外植体类型、生长调节物质、培养条件等[6]。本文对影响果树体细胞胚胎发生过程中的内外因素进行综述，以期为果树基因工程和细胞工程育种提供参考。

1 内因

1.1 基因型

基因型是影响果树体细胞胚发生的主要内因。番木瓜和猕猴桃的两性体比雄性体更易产生体胚。不同荔枝品种的同类外植体诱导胚性愈伤组织的频率不同[7]。同一外植体的不同柑桔品种诱导胚性愈伤组织的能力也存在显著差异[8]。欧洲葡萄较沙地葡萄和圆叶葡萄更难产生胚性愈伤[9]。王傲雪等[10]认为，不同基因型的适宜诱导培养条件不同，从而导致体细胞胚发生频率不同。体细胞胚的发生受基因的限制，胚性细胞或细胞团形成体胚的过程是基因新一轮表达的结果。

1.2 外植体

选择适宜的外植体是诱导体细胞胚发生的关键因子之一。常见的外植体有花药、子叶、胚轴、成熟胚、幼胚、子房、茎尖、叶片、花瓣等。郏艳虹等[11]研究表明，草莓的花药、花芽、叶片、叶柄、子叶、下胚轴均可诱导出体细胞胚，但诱导率存在显著差异，以花芽诱导率最高，可达61.74%。苹果珠心的珠孔端细胞能形成体细胞胚，而合点端却不能[12]。邓正正[13]对胡桃楸体细胞胚诱导的研究表明，只有授粉后13周的胚轴产生了20%的体细胞胚，而不同时期的子叶、胚根和种胚均未诱导出胚状体。罗君琴等[8]认为，柑桔的下胚轴诱导胚性愈伤组织能力强于子叶、幼根及上胚轴。Ruan JY等[14]认为，幼胚的发育程度对胚性愈伤组织的诱导起决定性作用。张健等[15]以授粉后50 d的柑桔幼胚为外植体，经直接发生途径诱导体细胞胚高频发生率。但也有人[16]认为，在幼胚的发育过程中，只有一个较短的阶段具有很强的体细胞胚发生潜能。

2 外因

2.1 培养基

用于果树体细胞胚发生常见的培养基有MS、B5、NN69、DKW、WPM等，其中MS为最常用的培养基，因其含有NH4NO3较高，利于果树体细胞胚的发生[7]。但不同的果树种类对基本培养基的选择也有物种特异性，在葡萄体细胞胚发生过程中也有使用液体培养基的报道[9]。柑桔在MT固体培养基的愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生之间的比率最佳[17]。多数学者[18-20]采用MS培养基成功诱导出胚状体。而McGranahan等[21]认为DKW是核桃体细胞胚发生的首选培养基，WPM更适用于黑核桃。

2.2 碳源

糖类不仅是体细胞胚碳源的主要来源之一，而且作为渗透剂调节培养基的渗透势，影响体细胞胚发生的速度和生长量。Yancheva等[22]研究发现葡萄糖和果糖二者结合可提高无核葡萄胚性愈伤组织的诱导率。但多数果树体细胞胚诱导中常以3%的蔗糖作为碳源。但枣的胚状体成苗培养基需将蔗糖浓度提高到5%[18]。荔枝幼胚在胚性愈伤组织分化过程中所需适宜的蔗糖浓度为5%，其诱导率可达64.2%，若蔗糖高于8% 则显著地抑制了胚性愈伤组织分化[23]。

2.3 外源激素

诱导体细胞胚的发生需要生长素和细胞分裂素配合使用，细胞分裂素与赤霉素类在体细胞胚的发生和发育过程中起协同作用[24]。在体细胞胚发育后期，ABA作为调节胚胎晚期发育的关键因子起着重要的作用。只有通过调节外源激素与内源激素的平衡，才能成功获得体细胞胚，形成完整植株。

2.3.1 胚性愈伤组织诱导阶段 胚性愈伤培养作为成功获得体细胞胚的重要阶段，是体细胞胚发生间接途径必须经历的中间阶段。胚性愈伤培养过程中外源激素添加物的重要成分是2,4-D，在番瓜、葡萄、甜樱桃、桃、板栗、芒果等果树体细胞胚诱导中广泛使用[25]。周丽侬等[23]认为，2,4-D虽然对荔枝幼胚的胚性愈伤组织诱导起决定性作用，但阻碍体细胞胚的进一步发育。而在利用中国樱桃对樱桃的不定根诱导胚性愈伤组织中，2,4-D起促进作用[26]。郝建平等[19]则认为，枣胚在2,4-D中2.0 mg/L激素条件下形成愈伤组织再转入ZT 1.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L的培养基中，可获的淡黄色、颗粒状胚性愈伤组织。除了2,4-D及其与细胞分裂素的组合之外，TDZ也能成功获得体细胞胚。但TDZ对植物体细胞胚发生的作用因植物种类而异，有的促进，有的抑制，TDZ对体细胞胚发生的作用可能与浓度与处理时间有关[27]。

2.3.2 体细胞胚的发生阶段 在胚性愈伤组织的增殖阶段，应及时去掉或降低生长素浓度，这样有利于提高增殖率，而且有利于体细胞胚的发生。谢玉明等[28]将荔枝花药培养胚性愈伤组织置于MS培养基上获得大量的胚状体，但后期体细胞胚成熟较慢。灰枣在激素BA 0.5 mg/L和NAA 0.01 mg/L的条件下获得大量的体细胞胚。六月鲜枣体胚发生的研究表明，添加2,4-D的培养基未能获得大量胚状体，而是在添加IAA的培养基中产生了大量胚状体。

2.3.3 体细胞胚的成熟及萌发阶段 一般来说，体细胞胚一旦分化出来就可以在无激素的培养基上成熟并发育成植株。如，柿下胚轴诱导形成的体细胞胚在无激素的培养基中成苗[29]。但许多果树的体细胞胚发育成熟与转化需要一些特殊条件，葡萄体细胞胚不经处理只有3%具有成熟结构[30]。在培养基中添加ABA可促进体细胞胚的成熟和萌发[31]。ABA是调节胚胎晚期发育的关键因素，可促进胚胎发育和种子脱水成熟，抑制体细胞胚的早熟萌发[32]。ABA在针叶树种和龙眼、胡萝卜、玉米、枸杞等植物体细胞胚发生过程中的作用已有较多研究[33]。关于ABA在果树体细胞胚发生的研究较少。Cochba J.等认为，低浓度的ABA可促进柑桔体细胞胚发育[34]。用10 μmg/L ABA能明显增加野生樱桃的白色体细胞胚的发生[35]。此外，培养基中添加GA3可提高芒果珠心组织[36]和草莓叶片[37]体细胞胚的萌发。

2.4 其他添加物

培养基中有机附加物、渗透剂的添加等因素也会影响果树体细胞胚的发生、发育。但不同物质的影响在培养不同材料时效果有较大差异。甜樱桃胚性愈伤组织增殖过程中，添加200 mg/L的水解酪蛋白(CH)可以提高增殖效果[38]。六月鲜枣体细胞胚萌发时添加CH100 mg/L可促进萌发成苗。此外，AgNO3水解乳蛋白(LH)、椰乳(CM)的添加也会促进体细胞胚的发育。

2.5 环境条件

合子胚的发育在生理避光条件下的子房中进行，体细胞胚的发育与合子胚相似。因此，多数研究深入开展了光照条件对体胚诱导或发育的影响。暗处理对于荔枝叶片、草莓叶片、葡萄叶片等果树胚性愈伤组织有显著的影响[5]。对苹果叶片体细胞发生的研究发现，黑暗处理有利于体细胞胚的发生，光照条件下生长缓慢且多形成畸形胚[39]。而有些研究[40]认为在光照条件下利于体细胞胚的发生，适宜的培养条件在很大程度上能影响胚性愈伤组织的产生。

3 存在问题和今后的研究方向

体细胞胚是由体细胞发育成的胚，其发生途径是细胞全能性表达最完全的一种方式。它不仅表明植物体细胞具有全套遗传信息，而且重演了合子胚形态发生的进程。胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚发生过程都与基因型、外植体、培养基的营养成分、激素水平、添加物、培养条件等因素关系密切。目前，体细胞胚发生的研究在基因工程、种质、人工种子、苗木快繁、杂种合子胚挽救、多倍体植株诱导、体细胞融合、转基因植物培育等方面有着广阔的应用前景。关于果树的体细胞胚发生研究已取得了一定的进展，但尚存在外植体取材的筛选、胚性愈伤诱导率和转化率低、体细胞胚发育不整齐等亟需解决的问题。尽管如此，许多工作者已深入开展体细胞胚发生、发育机制的研究，并应用基因工程以胚状体为受体获得核桃、黑核桃、葡萄及梅等多种转基因果树[5]。今后还需深入研究果树体细胞培养各个阶段的关键影响因子和作用机理，为实现基因工程在果树育种中的应用奠定基础。

[1]鲁旭东,萧浪涛,刘华英.脱落酸与植物体细胞胚胎发生关系的研究进展[J].生物技术通报,2003(5):19-26.

[2]王进茂,杨敏生,杨文利,等.我国木本植物体细胞胚胎发生研究进展[J].河北林果研究,2004,19(13):295-301.

[3]曾 超,代金玲,白玉娥,等.林木体细胞胚胎发生影响因子研究进展[J].安徽农业科学,2014,42(16):5100-5103.

[4]项伟波,赵金凯,吴家胜,等.香榧体细胞胚发生、发育的形态与细胞学观察[J].园艺学报, 2015,42(8):1477-1486.

[5]冀爱青,吴国良.果树体细胞胚胎发生研究进展[J].北方园艺,2011(13):188-193.

[6]Gambino G,Minuto M,Boccacci P.Characterization of expression dynamics of WOX homeodomain transcription factors during somatic embryogrenesis in Vitis vinifera[J].Journal of Experimental Botany.2011(62):1080-1101.

[7]陈夜江,赖钟雄.果树和林木体细胞胚胎发生的研究与利用[J].福建农业大学学报, 2001,30(3):420-426.

[8]罗君琴,徐建国,王 平.不同培养条件对柑桔胚性愈伤组织离体诱导的影响[J].北方园艺,2013(13):125-127.

[9]余智莹,徐志胜,张 萌,等.葡萄体细胞胚发生的研究进展[J].中国农学通报,2012，28(01):125-132.

[10]王傲雪,李景富.植物体细胞胚状体的诱导研究及应用[J].黑龙江农业科学,1999(2)：39-41.

[11]郏艳虹,熊庆娥.草莓胚状体形态发生的研究[J].四川农业大学学报,2003，21(3):263-266.

[12]张建瑛,杨 玲,沈海龙.蔷薇科植物体细胞胚胎发生及影响因素研究进展[J].生物技术通报,2007(3):35-38.

[13]邓正正.胡桃楸体细胞胚诱导的初步研究[J].辽宁林业科技.2015(3):22-23.

[14]Ruan Jianyun，Gerendás J，Hardter R，et al. Effect of nitrogen form and rootzone pH on growth and nitrogen uptake of tea (Ca-mellia sinensis) plants[J].Annals of Botany,2007,99(2):301-310．

[15]张 健，吕柳新.柑桔幼胚培养的直接体细胞胚发生与植株再生[J].河南科技大学学报(自然科学版).2006,26(6):82-85.

[16]耿菲菲,肖丰坤,吴 涛,等.思茅松成熟胚的胚性愈伤组织诱导与增殖[J].东北林业大学学报,2015,43(5):59-63.

[17]张俊娥.柑橘愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生的关系[J].广西植物,2010,30(5):682-685.

[18]李登科,杜学梅,王永康,等.六月鲜枣愈伤组织诱导及胚状体发生[J].果树学报,2004,21(5): 414-418

[19]郝建平,金竹萍,王永康,等.枣合子胚和体细胞胚发育过程的观察与比较[J].分子细胞生物学报,2006,39(5):423-430.

[20]张存智.枣幼胚愈伤组织诱导和胚状体发生[J].北方园艺,2011(13):125-127.

[21]McGrangan C H,Driver J A,Tulecke W.Tissue culture of Juglans. Bonga J M and Durzan D H Cell and Tissue Culture in Forestry[J].Martinus Nijhoff,Boston,1987,261-272.

[22]Yancheva S D,Roichev V.Carbohydrate source can influence the sufficiency of somatic embryogenesis in seedless grapes(Vitis vinifera L.)Biotechnol and Biotechnol[J].Eq,2005,19(2):62-66.

[23]周丽侬,邝哲师,马雪筠,等.影响荔枝幼胚体细胞胚胎发生因素的研究[J].农业生物技术学报,1996,4(2):161-165.

[24]李 明,王树香,冯大领.植物体细胞胚发生及发育研究进展[J].中国农学通报,2011,27(3):237-241.

[25]汤浩茹,王永清,任正隆.果树的体细胞胚发生[J].四川农业大学学报,1999,17(1):69-77.

[26]闫国华,张开春,周 宇.中国樱桃对樱桃不定根离体再生植株的研究[J].园艺学报,2003,30(5):583-585.

[27]陈云凤,张春荣,黄 霞.TDZ对植物体细胞胚胎发生的作用[J].植物生理学通讯, 2006,42(1):127-133.

[28]谢玉明,易干军,张秋明.荔枝“妃子笑”品种花药培养及其体胚发生[J].热带作物学报,2006,27(1):68-72.

[29]Sugiura A,Matsuda-Habu Y,Gao M,et al.Somatic emnryogenesis and plant regeneration from immature persimmon(Diospyros kaki Thunb.)embryos[J].Hort.Sci.,2008,43(1):211-214.

[30]Faure O.Embryons somatic of vitis rupestris and embryo zygotic of Vitis sp:morphologies, histochemiches and development Can[J].J.Bot,1990(68):2305-2315.

[31]姚 娜.不同基因型毛白杨离体再生及细胞悬浮培养的比较研究[J].北京：北京林业大学,2007.

[32]高述民，李凤兰. ABA对植物体细胞胚胎发育影响的研究进展[J].北京林业大学学报, 2002,7(4):122-128.

[33]孙 丹,李宏博,李 千,等.北五味子体细胞胚发生过程中内源IAA、ABA和GA3含量的动态变化[J].植物生理学报,2013,49(1):70-74.

[34]Cochba J.,Spiegel-Roy P.,Neumann H.,et al.Stimulation of embryogenesis in citrus ovular callus by ABA,cthcphon,CCC and alar and its suppression by GA3Z[J]. Pflanzenphysiology,1978(89):427-432.

[35]Reidiboym T L,Diemer F,Sourdious M.Improvement of somatic embryogenesis in wild cherry (Prunus avium) effect of maltose and ABA supplements[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture,1998,55(3):199-209.

[36]Ara H,Jaiswal U,Jaiswal V S. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration in Amrapali and Chausa cultivars of mango(Mangifera indica L)[J].Cur.Sci.,2000,78(2):164-169.

[37]Karami O,Kordestani G K,Mohamadi M,Direct somatic embryogenesis and plant regeneration in strawberry(Fragaria ananssa)[J].J.Plant Physiol,2007,12(4):322-326.

[38]吴雅琴,赵艳华,刘国俭.甜樱桃体细胞胚胎发生及植株再生的研究[J].华北农学院,2006,21(2):125-128.

[39]达克东,张 松,李雅志.苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生研究[J].园艺学报,1996,23(3):241-245.

[40]冯 貂,张金兰,金 强,等.灰枣体细胞胚胎发生与植株再生研究[J].2009, 21(1): 30-34.

2016-03-25

山西省青年科技研究基金(2015021163)；枣种质资源创新与利用山西省科技创新重点团队；果树种质创新与利用山西省重点实验室。

任海燕(1982-)，女，助研，硕士，主要从事枣种质资源与育种研究。E-mail：haiyan_101012@163.com

1005-345X(2016)04-0019-04

S601

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