变形链球菌粘附抑制多肽的研究进展

石佳伟 综述姜颖 审校

(广东医学院，广东 湛江 524000)

变形链球菌粘附抑制多肽的研究进展

石佳伟 综述姜颖 审校

(广东医学院，广东 湛江 524000)

变形链球菌是人类龋病的主要致病菌，该菌在牙面粘附聚集并形成致龋性微生态环境-牙菌斑，进而导致龋病发生。变形链球菌粘附的表面粘附素主要有表面蛋白(PAc)、葡萄糖基转移酶(Gtf)等。针对这些粘附素设计的粘附抑制多肽为龋病的预防带来了一种全新的可能。本文就变形链球菌粘附素的特点及变形链球菌粘附抑制多肽的研究进展做一综述，有望建立一种简单、安全、有效的新型防龋方法。

变形链球菌；粘附；多肽；龋病

龋病是口腔的常见病，它与肿瘤和心血管疾病被世界卫生组织并列为人类三大重点防治疾病。龋病发生的主要原因是变形链球菌粘附于牙表面，形成致龋性微生态环境-牙菌斑，并不断地代谢碳水化合物产酸，导致牙体硬组织脱矿。变形链球菌粘附于牙面主要通过初始粘附以及蔗糖依赖性粘附两种机制。在这两种机制中变形链球菌粘附素表面蛋白(PAc)、葡萄糖基转移酶(Gtf)等扮演了重要角色。近几十年来，随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的发展,变形链球菌粘附机制认识的逐步深入，国内外学者发现针对变形链球菌中与粘附功能相关的氨基酸序列制作的粘附抑制多肽可有效抑制变形链球菌在牙面的粘附，已经成为防龋研究的热点。本文就变形链球菌粘附素的特点及变形链球菌粘附抑制多肽的研究进展做一综述。

1 变形链球菌粘附机制

1.1 变形链球菌的初始粘附 变形链球菌粘附于牙面主要通过初始粘附以及蔗糖依赖性粘附两种机制。初始粘附是指由于细菌表面的蛋白成分和牙面获得性膜中凝集素相互作用，进而选择性地粘附于相应组织表面并定居下来的过程。初始粘附又称非特异性粘附、非蔗糖依赖性粘附。变形链球菌粘附素表面蛋白(PAc)在其中发挥重要作用。

1.2 变形链球菌的蔗糖依赖性粘附 经初始粘附后，变形链球菌在Gtf的作用下利用蔗糖，合成水不溶性葡聚糖来介导该菌的不可逆性粘附，即蔗糖依赖性粘附。确保细菌定植于牙面，逐渐形成龋发生的局部环境，从而使龋齿得以发生[1]。

2 抑制变形链球菌初始粘附的多肽

2.1 根据变形链球菌PAc合成的多肽 在变形链球菌初始粘附过程中，表面蛋白扮演了重要的角色。变形链球菌表面蛋白又称AgⅠ/Ⅱ、P1及PAc等，属于粘附素AgⅠ/Ⅱ家族，主要存在于变形链球菌菌体胞壁，由SpaP基因或Pac基因编码。表面蛋白与唾液凝集素相互作用涉及复杂的构象，可能存在多个粘结活性位点[2]。有研究证实A区与P区均在表面蛋白的表达和粘附中起重要作用[3]。C末端的附着能力大部分由C1C2区(aa 992-1332)决定[4]。C1C2区可与唾液糖蛋白gp-340结合并且含有主要粘附表位[5]。Larson等[6]认为：表面蛋白与唾液凝集素的结合可能发生于两个部位，一个是位于A3VP1内的鱼钩状结构，再一个可能是在C末端内。因此针对其可能的粘附区域来合成多肽，可有效抑制变形链球菌在牙面的粘附。

Li等[7]基于表面蛋白C末端C1区的1 025～1 044氨基酸残基序列合成人工多肽p1025，并将其添加至牙膏中，分别进行体外及体内实验。体外实验表明：p1025能与细菌粘附素竞争吸附牙面的唾液蛋白受体，从而抑制细菌粘附于羟基磷灰石。50 mmol/L为该多肽粘附抑制的最佳浓度。体内实验选择30名 22～23岁的志愿者进行实验。志愿者应用含多肽p1025的牙膏刷牙1个月后，取样品制得的平板中变形链球菌总数[log(3.11±0.80)]显著低于对照组[log (4.09±0.90)](P＜0.01)。

2.2 根据植物提取物合成的多肽 有研究者[8]根据洋紫荆植物血凝素(BVL)合成重组洋紫荆植物血凝素(rBVL-I)多肽。这种重组的多肽具有生物活性，能够抑制变形链球菌对唾液包被的羟基磷灰石的初始粘附，而不对该菌的生长造成影响，可以在不引起菌群失调的情况下降低龋病的发生。

2.3 根据同源序列合成的多肽 SspA和SspB是戈登链球菌中目前研究最多的也是起重要作用的表面蛋白。对SspA，SspB、Pac等多肽的预测氨基酸序列研究中发现它们之间存在广泛的序列同源性和共同结构特征[9]。Okuda等[10]根据戈登链球菌SspB(aa 390～400)片段合成一种小分子多肽能与唾液受体结合，该多肽不仅能抑制戈登链球菌对羟基磷灰石的粘附也能抑制变形链球菌对羟基磷灰石的初始粘附，从而降低患龋风险。

3 抑制变形链球菌蔗糖依赖性粘附的多肽

为针对变形链球Gtf合成的多肽，Gtf是变形链球菌合成的固有酶。人类口腔中主要存在三种Gtf，分别为Gtf-I、Gtf-S和Gtf-SI。Gtf-I合成水不溶性葡聚糖;Gtf-SI合成水溶性和水不可溶性的葡聚糖;Gtf-S合成水溶性葡聚糖。其中水不溶性葡聚糖具有黏性，在变形链球菌的蔗糖依赖性粘附中发挥重要作用[11]。Gtf具有两个功能区：氨基端1/3肽段的催化活性(CAT)区和羧基端约1/3肽段的葡聚糖结合(GLU)区。CAT区具有催化蔗糖水解产生水溶性葡聚糖(WSG)和水不溶性葡聚糖(WIG)的能力。GLU区则能与葡聚糖产生特异性、不可逆的结合。通过Gtf的作用，变形链球菌可以粘附于牙体表面，导致龋病发生。

变形链球菌CAT区具有催化功能，因而抑制该区段的功能可能对抑制龋病的发生有重要作用。Eto等[12]根据葡糖基转移酶Gtf-I合成了22个可能具有抑制Gtf酶活性作用的多肽，其中根据Gtf-I 1 176～1 194氨基酸残基序列(DGQVQYFDEMGYQA KGKFV)合成的多肽可抑制葡糖基转移酶活性达75%以上，在抑制蔗糖水解的同时也能抑制葡萄糖转化成葡聚糖，对变形链球菌的粘附有一定抑制作用。

酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，通过生物技术制得的具有生物活性的多肽。有实验表明[13]，K-酪蛋白磷酸多肽能降低Gtf粘附至羟基磷灰石，也能影响酶的活性，使菌斑中合成的葡聚糖减少47%以上进而干扰变形链球菌的蔗糖依赖性粘附。Emamieh等[14]将添加酪蛋白磷酸肽钙磷复合体(CPP-ACP)的口香糖与添加木糖醇的口香糖的抑龋效果进行比较，发现含CPP-ACP的口香糖和含木糖醇的口香糖均可有效控制变形链球菌的生长，但前者临床治疗效果更为显著，并且无毒副作用。

4 展 望

长期以来，学者们针对变形链球菌进行了大量研究，期望建立起有效的防龋措施。国内外目前的研究大量集中在对氟化物的推广以及防龋疫苗的应用上[15]。但随着时间的推移，这些措施已暴露出一些问题：(1)适量使用氟化物防龋能在一定程度上控制龋病的发生，但是在口腔长期大量使用时，可能导致耐氟菌株产生[16]。有关研究显示耐氟菌株与亲代菌株在产酸性、粘附能力及基因序列等方面有所差异，但是其致龋能力却和亲代菌株相似[17-18]。耐氟菌株存在的情况下单纯使用氟化物防龋存在一定局限性。(2)针对变形链球菌的防龋疫苗主要有全菌疫苗、纯抗原亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因工程重组疫苗、DNA疫苗等。防龋疫苗通常采用口服和鼻腔免疫，目前主要在安全性、合理的载体或投递系统的寻找、免疫剂量及免疫持续时间等方面还有许多问题有待解决。

将针对变形链球菌粘附素合成的多肽局部应用于口腔，能率先占据并结合唾液蛋白受体从而竞争性抑制变形链球菌的粘附或者通过影响酶的表达水平而抑制变形链球菌的粘附。不存在诱发菌群失调及耐药菌株形成等问题。有望建立起一种更简单、安全、有效的龋病预防方法，将会获得更好的防龋效果，成为其他几种防龋措施的有力补充。不过如何长期维持合成多肽有效的粘附抑制浓度、多肽的贮存等还需要更进一步的研究。

[1]Liu GX,Xu QA,Jin J,et al.Mucosal and systemic immunization with targeted fusion anti-caries DNA plasmid in young rats[J]. Vaccine,2009,27(22):2940-2947.

[2] Brady LJ,Piacentini DA,Crowley PJ,et al.Differentiation of salivary agglutinin-mediated adherence and aggregation of mutans streptococci by use of monoclonal antibodies against the major surface adhesin P1[J].Infect Immun,1992,60(3):1008-1017.

[3]Matsumoto-Nakano M,Tsuji M,Amano A,et al.Molecular interactions of alanine-rich and proline-rich regions of cell surface protein antigen C in Streptococcus mutans[J].Oral Microbiol Immunol,2008, 23(4):265-270.

[4]Heim KP,Crowley PJ,Long JR,et al.An intramolecular lock facilitates folding and stabilizes the tertiary structure of Streptococcus mutans adhesin P1[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(44): 15746-15751.

[5]Larson MR,Rajashankar KR,Crowley PJ,et al.Crystal structure of the C-terminal region of Streptococcus mutans antigen I/II and characterization of salivary agglutinin adherence domains[J].J Biol Chem, 2011,286(24):21657-21666.

[6] Larson MR,Rajashankar KR,Patel MH,et al.Elongated fibrillar structure of a streptococcal adhesion assembled by the high-affi nity association of alphaand PPII-helices[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(13):5983-5988.

[7]Li MY,Wang J,Lai GY.Effect of a dentifrice containing the peptide of streptococcal antigen I/II on the adherence of mutans streptococcus[J].Arch Oral Biol,2009,54(11):1068-1073.

[8]Klafke GB,Borsuk S,Gonçales RA,et al.Inhibition of initial adhesion of oral bacteria through a lectin from Bauhinia variegata L.var. variegata expressed in Escherichia coli[J].J Appl Microbiol,2013, 115(5):1222-1230.

[9]Stevenson B,Choy HA,Pinne M,et al.Leptospira interrogans endostatin-like outer membrane proteins bind host fibronectin,laminin and regulators of complement[J].PLoS One,2007,2(11):e1188.

[10]Okuda K,Hanada N,Usui Y,et al.Inhibition of Streptococcus mutans adherence and biofilm formation using analogues of the SspB peptide[J].Arch Oral Biol,2010,55(10):754-762.

[11]Banas JA,Vickerman MM.Glucan-binding proteins of the oral streptococci[J].Crit Rev Oral Biol Med,2003,14(2):89-99.

[12]Eto A,Saido Tc,Fukushima K,et al.Inhibitory effect of a self-derived peptide on glucosyltransferase of Streptococcus mutans.Possible novel anticaries measures[J].J Biol Chem,1999,274(22): 15797-15802.

[13]Vacca-Smith AM,Bowen WH.The effect of milk and kappa casein on streptococcal glucosyltransferase[J].Caries Res,1995,29(6): 498-506.

[14]Emamieh S,Khaterizadeh Y,et al.The effect of two types chewing gum containing casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate and xylitol on salivary Streptococcus mutans[J].Journal of Conservative Dentistry,2015,18(3):192-195.

[15]储婷,孔凡芝,江玉凤,等.渗透树脂和氟化物处理早期龋的三年临床研究[J].海南医学,2015,26(20):3082-3084.

[16]Ko L,Thiessen KM.A critique of recent economic evaluations of community water fluoridation[J].Int J Occup Environ Health,2015, 37(1):91-120.

[17]Liao Y,Chen J,Brandt BW,Zhu Y,et al.Identification and functional analysis of genome mutations in a fluoride-resistant Streptococcus mutans strain[J].PLoS One,2015,10(4):e0122630.

[18]许华,刘英群.变异链球菌耐氟菌株的致龋能力[J].国际口腔医学杂志,2013,40(5):698-700.

Research progress on adhesion-inhibiting peptides of Streptococcus mutans.

SHI Jia-wei,JIANG Ying.Guangdong Medical College,Zhanjiang 524000,Guangdong,CHINA

Streptococcus mutans(S.mutans)is considered as a primary cariogenic bacterium.Its ability of adherence and further accumulation on teeth to generate dental biofilm constitutes an important condition for dental caries. Adhesins generated by S.mutans include cell surface protein antigen AgI/II(PAc)and the glucosyltransferase(Gtf)enzyme,etc.A new possibility may be brought in to prevent dental caries with adhesion-blocking synthetic peptides designed specifically for such adhesions.In this paper,we summarize the characteristics of adhesins and make a survey of recent progress on adhesion-inhibiting peptides of Streptococcus mutans.We also propose a simple,safe and efficient way to prevent caries.

Streptococcus mutans;Adherence;Peptide;Dental caries

R378.1+2

A

1003—6350（2016）05—0777—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.031

2015-11-02)

广东省医学科研基金立项课题(编号：A2013435)；广东医学院附属医院博士科研启动基金(编号BK201211)

姜颖。E-mail：jy197701@163.com