视网膜母细胞瘤基因治疗的研究进展

葛茸茸，沈奕伶，高　玉

·综述与讲座·

视网膜母细胞瘤基因治疗的研究进展

葛茸茸，沈奕伶，高玉

[关键词]视网膜母细胞瘤；基因治疗；研究进展

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)来源于光感受器前体细胞，是小儿最常见、危害性最大的眼内恶性肿瘤，严重威胁患儿的视力甚至生命，其发病率约为1/15 000～1/20 000，多见于婴幼儿，6岁以前发现病情者占绝大多数[1]。RB早期可不影响视力，肿瘤一般体积很小且位于视网膜周边部，很难及时、准确地发现，容易漏诊。多数患儿是在眼部出现症状以后才被注意，而此时确诊，大多已是中晚期。传统的治疗主要是单独或联合应用眼球摘除术、外照射放射治疗、局部治疗等方法；化学减容法是保守治疗的主要方法之一；局部治疗主要有激光光凝、经瞳孔温热疗法、光动力疗法、冷冻治疗、巩膜敷贴放疗等。但上述方法往往缺乏针对性，存在特异性的破坏性损伤，安全性低、全身和/或局部不良作用严重，甚至发生肿瘤种植、诱发第二恶性肿瘤等诸多问题[2]。随着肿瘤分子生物学与基因工程技术的发展，加之眼球作为靶组织独具的解剖优势，在RB治疗领域，基因治疗作为一种新型生物治疗手段，呈现出良好的应用前景。现将近年来RB基因治疗的研究进展作一综述。

1RB基因替代疗法

RB的发病与Rb基因的缺失或失活密切相关。Rb基因是随着RB的研究而最早被发现的一种抑癌基因，其蛋白质产物在人体内发挥着诸如调节分化、转录、细胞周期等重要作用。Rb基因与其蛋白表达物的失活会导致细胞分裂不受控制地、非正常地增长而发生永生化，最终引发肿瘤。对于家族遗传性患者，其出生前生殖细胞中的Rb基因已经发生过一次突变，还有一个正常的等位基因没有发生突变，但该正常等位基因通常会由于偶然的原因失活，进而引发癌症；对于非家族性遗传患者而言，需要发生两次突变才会发病，这种几率相对较低；其他的突变类型包括无功能突变、启动子突变等。针对缺失或失活Rb基因的治疗策略，不仅对患病个体的临床治疗有重要作用，对患病个体的兄弟姐妹以及后代患病状况的监测同样具有重要意义。Xu等[3]的研究显示，将外源性Rb基因导入RB细胞，替代其缺陷Rb基因，能有效抑制肿瘤细胞生长，同时还能抑制肿瘤细胞永生化所必需的端粒酶活性，进而导致RB肿瘤细胞死亡。但目前，RB基因替代疗法的作用仅限于被转染的肿瘤细胞，如何改进治疗基因的传递载体、提高肿瘤细胞的转染效率，已成为其疗效的关键点。RB有很高的自发退变率，是其他恶性肿瘤的近千倍[4]，这似乎预示着肿瘤完全有可能被攻克。人体细胞自身就存在对肿瘤细胞生长具有拮抗作用的抑癌基因等相关因子，能否揭示RB发病及自发退变的机制，已成为攻克RB及其他恶性肿瘤的关键。

2导入抑癌基因治疗

除Rb基因外，p53和p21等抑癌基因的突变与失活，对RB的发生、发展，同样也起着非常重要的作用。p53基因作为与人类肿瘤相关性最高的基因，至今被认为是机体抵抗癌症的主要防线。自1979年起的十多年时间里，人们对 p53基因的认识，主要经历了癌蛋白抗原、癌基因到抑癌基因等3个阶段。目前已经公认，具有促进肿瘤形成或细胞转化作用的p53蛋白，是p53基因突变的产物；野生型p53基因是一种抑癌基因，但在发生突变或失活后，不仅不能抑制肿瘤增殖，反而会具备癌基因的相关功能。p21基因属于细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族，在细胞周期控制及肿瘤发生方面具有重要作用。Audo等[5]将p53和p21分别导入RB细胞，均能抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡。国内亦有研究显示[6]，野生型p53基因具有抑制RB细胞生长的作用。p53基因能抑制肿瘤细胞生长、促使肿瘤细胞凋亡，还能帮助细胞基因修复缺陷，但这一功能对于因化疗药物等作用而受伤的肿瘤细胞，却又起到修复作用，从而造成被修复的肿瘤细胞在治疗后成为新的肿瘤。

3自杀基因治疗

自杀基因又称前体药物酶转化基因，自杀基因治疗的原理是将某些病毒或细菌的基因(既自杀基因)导入肿瘤细胞，该基因表达的酶催化无毒或低毒的药物前体代谢为细胞毒性物质，干扰受体肿瘤细胞DNA合成，从而引起肿瘤细胞的自杀效应[7]。单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统，既将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因导入肿瘤细胞，联合应用更昔洛韦，进行自杀基因治疗，目前被认为是针对玻璃体腔内种植性RB最为有效的一种治疗方法。Hurwitz等[8]研究表明，含胸苷激酶自杀基因的重组腺病毒(ADV-TK)联合更昔洛韦，能有效杀死人RBY79细胞。张永红等[9]研究肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK对人RBY79细胞的体外杀伤作用，其结果显示，双前体药物的杀伤作用明显大于单前体药物。自杀基因治疗具有“旁观者效应”，不仅导入自杀基因的肿瘤细胞自身被杀死，与其临近或远处未被转染的肿瘤细胞，也会因为毒性物质通过细胞间缝隙连接的转运而被杀死。“旁观者效应”弥补了肿瘤细胞转染效率低的缺陷，有效增强了自杀基因的杀伤效能。正常的免疫系统可能对“旁观者效应”起着重要作用[10]。自杀基因治疗有着良好的应用前景，但要真正用于临床，诸如对眼内正常细胞的不良作用等许多问题还有待深入研究和解决。靶向性传递自杀基因至靶细胞，“旁观者效应”仅对未转染的肿瘤细胞起作用，可能是自杀基因治疗将来的一个重要发展方向。

4抗血管生成基因治疗

肿瘤生长依赖新生血管形成以获取营养、氧气及排出废物；当实体肿瘤直径达到或超过1～2 mm，由于新生血管的形成与长入，肿瘤组织将迅速生长，其浸润和转移能力也将不断增强，若无新生血管，肿瘤组织则发生退化[11]。新生血管还能为肿瘤细胞提供转移通道。抗血管生成基因治疗以肿瘤新生血管为靶点，将相关基因转导入肿瘤及其周围组织，通过抑制新生血管生成切断肿瘤生长、转移所依赖的营养微环境，既以“饥饿疗法”达到杀死肿瘤细胞、治疗肿瘤的目的[12]。血管内皮细胞生长因子(VEGF)，是唯一特异作用于血管内皮细胞的血管调控因子，能直接刺激血管内皮细胞增殖、诱导迁移及管腔样结构形成，还能增加微血管的通透性[13]。有研究证实，VEGF在RB组织中高表达，且能促进RB的恶性进程[14]。以VEGF作为治疗靶点的抗血管生成基因治疗，已成为目前治疗RB的重要策略之一。但肿瘤血管的生成，是促血管生成因子和抑制因子协调作用、共同参与的复杂过程，仅针对某个单一血管调控因子，是很难真正完全性抑制肿瘤血管生成的。即便实体肿瘤因有效治疗，体积缩小到一定程度，但幸存肿瘤细胞可从组织间液获取营养。故而，单纯依靠抗血管生成基因治疗很难彻底根除肿瘤。抗血管生成基因治疗需与化疗、放疗或手术等其他方法联合实施。有观点认为，血管生长抑制剂和细胞因子免疫疗法的联合应用，可能成为根治恶性肿瘤的有效手段[15]。

5促凋亡基因治疗

黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7)，又被称为白细胞介素-24(IL-24)，通过抑制血管生成、激活生长抑制DNA损伤基因(growth arrest and DNA damage,GADD)等途径，选择性杀死肿瘤细胞、促进细胞增殖阻滞及诱导细胞凋亡[16]。将编码MDA-7的腺病毒载体导入RB组织(CB/17SCID鼠皮下RB模型)，肿瘤细胞出现凋亡，肿瘤体积明显缩小[17]，MDA-7/IL-24有望成为RB基因治疗的重要因子。由于MDA-7蛋白可对周围未受转染的肿瘤细胞产生“旁观者效应”[18]，采用MDA-7的促凋亡基因治疗，存在与自杀基因治疗类似的毒副作用。

6溶瘤性单纯疱疹病毒基因治疗

溶瘤病毒基因治疗通过病毒在肿瘤细胞内的复制增殖，造成肿瘤细胞裂解而杀死肿瘤细胞，细胞裂解后释放出来的病毒又可进一步感染周围的肿瘤细胞，具有级联放大作用。溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)是目前抗肿瘤作用最好的一种溶瘤病毒，沉默γ 34.5基因或核糖核苷酸还原酶基因的HSV突变株，能选择性地在肿瘤细胞中复制，导致肿瘤细胞裂解性死亡[19]。以往曾有多项关于HSV突变株应用于RB治疗的报道：HSV突变株对LHβTAg转基因小鼠RB动物模型的疗效有限[20]；其复制仅局限于恶性病灶区和视网膜色素上皮(病毒抗原免疫组化检测)[21]。而Kogishi等[22]的体外实验却提示，HSV突变株可在人RBY79细胞中复制且具有溶瘤细胞作用。这些研究结果的差异可能与实验对象(RB细胞、动物模型)的不同有关。由于HSV突变株存在引起受体眼部炎症、免疫和毒性反应的可能[23]，其应用也受到了一定的限制。

综上所述，基因治疗是通过纠正或补偿致病基因的缺陷，关闭或抑制异常基因的表达，而得以实现治疗RB的目的。眼内微环境相对独立于体循环系统，降低了转基因载体全身蔓延的几率，能有效减少甚至避免全身不良反应，相比其他部位的肿瘤，RB选择基因治疗具有一定优势。但在憧憬基因治疗应用前景的同时，尚不可忽视，基因治疗还不能完全杀死肿瘤细胞，应用于眼局部仍会出现炎症、免疫和毒性反应，对邻近RB正常细胞的不良反应仍有待解决，尤其，病毒载体本身及外源基因随机整合也会给受治者带来潜在危害。

总之，RB基因治疗离真正应用于临床还有一定距离，随着科技的进步和研究的深入，基因治疗将向着安全性、精密性、靶向性和高效性方向不断发展，以基因治疗为主体的综合治疗策略将得到不断完善，最终实现不仅要挽救RB患儿生命、保留眼球，还要保存有用视力以提高其生活质量。

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(本文编辑：莫琳芳)

[作者单位]200081上海，解放军第四一一医院眼科

[中图分类号]R774.1

[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.040

(收稿日期：2015-12-25)