RhoC在外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中的表达及意义

崔丹丹 张丽雅 武昕

RhoC在外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中的表达及意义

崔丹丹 张丽雅 武昕

目的探讨RhoC在外阴鳞状细胞癌(外阴鳞癌)及外阴硬化性苔藓中的表达情况,分析其在外阴疾病发生发展中发挥的作用。方法采用免疫组化方法检测RhoC在外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中的表达,并收集30例外阴鳞癌患者的临床病理资料进行分析。结果RhoC在外阴正常组织、外阴硬化性苔藓、外阴鳞癌中阳性细胞的平均光密度值分别为(22.42±1.23)、(36.07±2.75)、(83.51±2.84)。与外阴正常组织相比,RhoC在外阴硬化性苔藓中的表达显著增高(P<0.05)。在外阴鳞癌中的表达显著高于其在外阴硬化性苔藓与外阴正常组织中的表达 (P<0.05)。RhoC在Ⅰ～Ⅱ期外阴鳞癌组织中表达显著低于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05),在有淋巴结转移中的表达明显高于无淋巴结转移(P<0.05)。RhoC的表达与细胞分化及年龄无关。结论RhoC的表达与外阴鳞癌及外阴硬化性苔癣的发生、发展有关。

RhoC；外阴鳞状细胞癌；外阴硬化性苔藓；免疫组化

RhoC是Rho基因家族的成员之一,其具有GTP酶活性。Rho蛋白在基因转录、细胞周期调控、调控细胞形态、细胞迁移、恶性肿瘤的侵袭及转移中起重要作用。据文献报道RhoC在乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、食管鳞癌、前列腺癌及非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中异常表达,并与这些肿瘤的分期及转移相关［1-4］。外阴硬化性苔癣(vulvar lichen sclerosus,VLS)是一种常见的外阴上皮内非瘤样病变,以40岁左右的妇女多见,其次是幼女,主要症状为外阴搔痒、性交痛及外阴烧灼感。其中约有4%～7%患有外阴硬化性苔藓的妇女发展为外阴癌［5］。外阴鳞状上皮癌占外阴恶性肿瘤的80%以上,约60%左右患者合并有外阴硬化性苔藓［6］。目前两种疾病的病因及发病机制尚未完全弄清,并且外阴硬化性苔藓在什么情况下会进展为外阴鳞癌尚不清楚。因此本研究运用免疫组化的方法探讨RhoC的表达与外阴硬化性苔癣和外阴鳞癌发生、发展是否相关。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年1月～2013年7月中国医科大学附属第一医院病理科55例患者经手术切除及活检存档的蜡块,其中包括30例外阴鳞癌,15例外阴硬化性苔藓,10例正常外阴皮肤。所有患者临床及病理资料均完整,所有标本均经两位资深病理医师确认,术前均未行放化疗。收集外阴鳞癌患者的临床及病理资料进行统计分析：年龄36～68岁,平均年龄(52.8±5.9)岁。30例外阴鳞癌患者依据2009年国际妇产科联盟(FIGO)临床分期：Ⅰ期8例,Ⅱ期15例,Ⅲ期5例,Ⅳ期2例；分化程度：高分化18例,中分化7例,低分化5例。有淋巴结转移8例,无淋巴结转移22例。

1.2 实验试剂 兔抗人RhoC多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色液均购自北京博奥森生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化 石蜡切片均进行常规的脱蜡水化。3% H2O2于室温孵育10min从而灭活内源性过氧化物酶,然后再进行抗原修复。滴加5%BSA封闭液,室温20min,滴加适当一抗RhoC(1∶100)于4℃冰箱过夜,再滴加相对应的二抗生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育30min,链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液室温下孵育20min,最后进行DAB显色,苏木素复染,再进行封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 结果判定 阳性染色判断标准：光学显微镜下细胞浆或细胞膜出现黄色或棕黄色颗粒,运用BX60万能显微照相系统(OLYMPUS,日本)对切片进行图像采集,每张切片中选取5个不同视野,利用显微图像分析系统Meta Morph(UIC/ OLUMPUS.US/JP)计算每张切片的平均积分光密度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoC在外阴不同组织中的表达情况 RhoC蛋白于细胞浆及细胞膜上呈棕黄色颗粒为阳性表达。正常外阴组织中能够表达RhoC蛋白的细胞分布于基底细胞层,但在外阴硬化性苔藓中阳性表达细胞位于表皮中上层,在真皮细胞中未见此蛋白表达。在外阴鳞癌中的表达主要分布在癌巢的异型细胞中。RhoC在外阴正常组织中阳性细胞的平均光密度值为(22.42±1.23),在外阴硬化性苔藓中表达阳性细胞的平均光密度值为(36.07±2.75),外阴鳞癌中RhoC蛋白表达阳性细胞的平均光密度值为(83.51±2.84)。RhoC蛋白在外阴鳞癌、外阴硬化性苔藓与外阴正常组织相比差异有统计学意义(P<0.05),并且其在外阴鳞癌中的表达显著高于其在外阴硬化性苔藓的表达 (P<0.05)。见表1。

表1 RhoC在外阴不同组织中的表达情况(±s)

表1 RhoC在外阴不同组织中的表达情况(±s)

注：与外阴正常组织比较,aP<0.05；与外阴硬化性苔藓比较,bP<0.05

组织 例数 平均光密度值外阴正常组织 10 22.42±1.23外阴硬化性苔藓 15 36.07±2.75a外阴鳞癌 30 83.51±2.84ab

2.2 RhoC的表达与外阴鳞癌的临床病理特征的关系 RhoC在Ⅰ～Ⅱ期外阴鳞癌中表达为(74.13±2.73),Ⅲ～Ⅳ期为(89.69±1.23),比较差异有统计学意义(P<0.05)。在不同病理分级中表达为:高分化为(79.06±5.85),中低分化为(82.12±2.62)。不同病理分级比较差异无统计学意义 (P>0.05)。在有淋巴结转移中为(86.23±1.59),明显高于无淋巴结转移的(74.63±2.56)(P<0.05)；RhoC的表达与年龄无关(P>0.05)。见表2。

表2 30例外阴鳞癌患者RhoC的表达与临床病理特征的关系(±s)

表2 30例外阴鳞癌患者RhoC的表达与临床病理特征的关系(±s)

注：不同临床分期、有无淋巴结转移比较,aP<0.05

指标 例数 RhoC P年龄 ≤45岁 7 82.50±1.70 >0.05 >45 23 80.32±2.01临床分期 Ⅰ～Ⅱ期 23 74.13±2.73a<0.05Ⅲ～Ⅳ期 7 89.69±1.23病理分级 高分化 18 79.06±5.85 >0.05中低分化 12 82.12±2.62淋巴结转移 无 22 74.63±2.56a<0.05有8 86.23±1.59

3 讨论

在肿瘤的发生及发展中,细胞因子间的信号转导起着至关重要的作用。研究显示［6］,Ras超家族中Rho亚家族是细胞信号转导过程中的重要因子,其在肿瘤细胞生物学行为中主要是参与细胞骨架重组、应力纤维形成及调节细胞形状、极性、运动等。研究者根据结构和功能不同,将已发现的约20个Rho GTP酶超家族成员的大致分为5个亚家族,包括Rho亚家族,此亚家族又包括RhoA、RhoB 及RhoC三位成员。研究表明在大多数原发肿瘤中,RhoC发挥积极的调节作用。RhoC全称为Ras同源类似物C,RhoC的CDS全长为582bp,在基因组中的全长约为5 kb,定位于染色体1p21-p13。RhoC蛋白含193个氨基酸。RhoC 蛋白在细胞的多种生命过程均积极参与,其中最为重要的是调节肌动蛋白细胞骨架活动,其中,RhoC蛋白与桩蛋白(paxillin)、粘着斑激酶(FAK)、内收蛋白(adducing)和肌球蛋白轻链(myosin lightchain,MLC)等细胞骨架相关蛋白的磷酸化直接相关,并且还参与了细胞运动和迁移的调节。RhoC蛋白通过向下游靶效应分子ROCK (Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK)传递活化信号,继而磷酸化多个氨基酸位点,激活并介导下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应［7,8］。通过以上途径对调控细胞骨架的重建,同时参与并影响细胞迁移、增殖、转录、恶性肿瘤细胞的转移和浸润等多种生物学行为［9］。

在人类的恶性肿瘤中,有报道称对RhoC蛋白在乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌中过度表达,与之相一致,研究发现RhoC蛋白在外阴正常组织中弱表达,在外阴硬化性苔藓及外阴癌中高表达,而且与外阴正常组织相比差异有统计学意义(P<0.05),推测其与外阴硬化性苔藓及外阴癌的发生发展关系密切。其可能通过调节细胞凋亡及细胞转录等生物学行为在外阴硬化性苔藓病变的发生过程中发挥一定的作用,具体调节机制则有待进一步研究探讨。另外,RhoC 蛋白在有淋巴结转移及临床分期高的外阴癌病例中高表达。RhoC蛋白促进恶性肿瘤侵袭、转移的机制可能如下：①RhoC 蛋白通过 ROCK 信号转导通路调节肌动蛋白微丝骨架的聚合过程,进而影响细胞形态和极性,此通路还能促进恶性肿瘤血管生成、协助肿瘤细胞穿越脉管内皮从而实现远处转移［10,11］；②RhoC 蛋白可通过影响细胞-细胞间、细胞-胞外基质的粘附从而参与调节细胞迁移；③RhoC 蛋白可以影响金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的水平,进而调节细胞外基质(extraceller matrix,ECM)的降解及重建,促进局部浸润的发生；④RhoC蛋白可以激活磷脂酶 C(PLC)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等多种酶类的信号转导途径,促进肿瘤的侵袭转移。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.22.010

2016-10-24］

110000 沈阳市妇婴医院(崔丹丹 张丽雅)；中国医科大学附属第一医院(武昕)

武昕