恶性疟原虫SURFIN4.1蛋白氨基端在介导蛋白转运过程中作用机制的研究

梁怡凡， 何 洋， 曹雅明， 朱晓彤*

(1.中国医科大学，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学基础医学院 免疫教研室，辽宁 沈阳 110122)

恶性疟原虫SURFIN4.1蛋白氨基端在介导蛋白转运过程中作用机制的研究

梁怡凡1， 何 洋2， 曹雅明2， 朱晓彤2*

(1.中国医科大学，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学基础医学院 免疫教研室，辽宁 沈阳 110122)

恶性疟原虫；SURFIN4.1；输出蛋白；PNEPs

全球范围内有效的疟疾防控措施已使疟疾致死率在过去20年中下降40%，然而疟疾作为世界范围内主要传染性病原体，仍有3.1亿人口受其感染威胁，每年200万人感染，100万人(86%为非洲地区5岁以下儿童)死亡[1]。近年，疟疾流行区青蒿素耐药虫株的出现和扩散，使疟疾的防治面临严峻的挑战[2]。因此，开发新型有效的疟疾防控手段是疟疾防治的当务之急。恶性疟原虫为主要致死性疟原虫，其致病性与疟原虫感染红细胞(parasite infected red blood cells，pRBCs)的黏附性增强相关。pRBCs可黏附于胎盘、血管内皮细胞、血小板和未感染红细胞，导致脑疟和胎盘疟疾等严重致死性并发症[3]。恶性疟原虫侵袭红细胞后向pRBCs胞浆输出上百种原虫蛋白，如KAHRP、PfEMP1、RIFIN和STEVORs等，上述表面定位蛋白与pRBCs黏附性增强密切相关[4-5]。茂氏点(Maurer’s clefts, MCs)是pRBCs胞浆中输出蛋白运输的“中转站”[6]。同时，MCs定位蛋白如SBP1、MAHRP1、MAHRP2、REX1和REX2在原虫pRBCs表面黏附性相关致病蛋白如PfEMP1蛋白的转运过程中发挥重要作用[7-8]。恶性疟蛋白质组学分析显示，500多种疟原虫外输出蛋白的氨基端(N端)均含有5个氨基酸“RxLxE/Q/D”组成的输出序列——PEXEL(PlasmodiumEXportELement)[9]。同时，恶性疟输出蛋白质组中也存在一系列N端不含PEXEL序列的蛋白，即PNEPs(PEXEL-negative exported proteins)，包含已知的MCs定位蛋白。上述PNEPs输出蛋白N端序列包含跨纳虫胞膜(Parasitophorous vacuole membrane, PVM)转运至MCs的部分转运信号，但其作用机制尚不明确。SURFIN4.1蛋白为MCs定位的疟原虫输出蛋白，其N端不含PEXEL序列，属于PNEPs蛋白成员，由surf基因家族(surface-associated interspersed genes,surfgenes)编码[10]。前期研究发现，SURFIN4.1蛋白N端50个氨基酸内含两个功能相同的转运序列，与其跨膜区和胞内尾共同作用可介导SURFIN4.1蛋白经由内质网-高尔基体经典转运途径，跨PVM转运至MCs[10]。然而SURFIN4.1蛋白N端在转运过程中的作用方式和特点尚不明确。本研究旨在探讨SURFIN4.1蛋白N端在转运过程中的特性和作用，从而探讨PNEPs蛋白在恶性疟中普遍机制，进而为有效疟疾疫苗的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 恶性疟原虫株 恶性疟原虫MS822株由日本长崎大学热带医学研究所中泽秀介教授惠赠。

1.1.3 主要试剂和仪器 RPMI 1640(Invitrogen)、AlbumaxI(Invitrogen)，10 μg/mL庆大霉素(Invitrogen)、次黄嘌呤(Sigma)、Incomplete Cytomix(120 mmol/L KCl、0.15 mmol/L CaCl2、2 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L K2HPO4/KH2PO4和25 mmol/L HEPES)由本室配制，限制性内切酶MluI、EcoRV、EcoRI、PstI(NEB)、MultiSite Gateway technology(Invitrogen)、LB broth(GIBCO)、快速质粒小提试剂盒(DP105，TIANGEN)、Q5®Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB)、PierceTMCrosslink IP 试剂盒(ThermoFisher Scientific)、鼠抗GFP单克隆抗体(Abcam)、anti-cMyc抗体(Abcam)，兔抗PfEXP2抗体和兔抗PfSBP1抗体由爱媛大学无细胞培养中心坪井教授馈赠，ECL化学发光底物试剂盒购自美国Pierce公司，WR99210(Sigma-Aldrich)，Gene PulserXcell电穿孔仪(Bio-Rad)，电转杯(Bio-Rad)。

1.2 方法

2 结果与分析

图和质粒的酶切鉴定Fig.1 Restriction enzyme digestion of plasmids and 载体EcoRV和MluI双酶切鉴定，克隆 #1～#3，4～7：空；载体EcoRI和PstI双酶切鉴定，克隆 #1～#4;M1:10 000 bp DNA分子量标准；M2:2 000 bp DNA分子标准A:Restriction enzyme digestion of plasmid with EcoRV and clone #1-#3,4-7:Blank;B:Restriction enzyme digestion of plasmid with EcoRI and clone #1-#4;M1:10 000 bp DNA marker; M2:2 000 bp DNA marker

图重组蛋白在恶性疟原虫的定位分析Fig.2 The location analysis of recombinant in Plasmodium falciparum重组蛋白结构示意图；B:重组蛋白荧光定位结果。DIC: 微差干涉反对，Nue: 细胞核，anti-Myc：抗Myc标签抗体，anti-EXP2：抗纳虫胞膜(PVM)抗体，anti-SBP1：茂氏点(MCs)定位蛋白检测抗体，anti-GFP：抗GFP抗体检测重组蛋白荧光定位，Merge：荧光融合后图片A:Schematic drawings of recombinant ；B:Representative fluorescence images showing the localization of recombinant . The differential interference contrast (DIC),fluorescence image with nucleus stain (Nue)，anti-Myc tagantibody,anti-EXP2：PVM marker, anti-SBP1: Maurer’s cleft detection antibody， anti-GFP: anti-GFP antibody detection of fluorescence signals for recombinant protein location,Merge: merge images

图重组蛋白的可溶性分析Fig.3 Solubility analysis of recombinant proteinA:对比分析和重组蛋白的可溶性差异。Tris：0.01 mol/L Tris,Na2：0.1 mol/L Na2CO3,Tx-100：0.1% Triton-X-100,SDS：2% SDS,箭头所示为目的蛋白条带和重组蛋白Western Blot 结果灰度分析A:The comparison of protein solubility between recombinant (2MycN-T-C) and (N-T-C).Tris: 0.01mol/L Tris, Na2:0.1 mol/L Na2CO3, Tx-100: 0.1% Triton-X-100, SDS: 2% SDS, The arrow indicates the target recombinant protein;B:Signal intensity analysis of recombinant (2MycN-T-C) and (N-T-C)’s Western blot results

2.4 Co-IP和LC-MS/MS试验检测与SURFIN4.1蛋白N端的相互作用蛋白

表1 SURFIN4.1重组蛋白N端相互作用蛋白LC-MS/MS结果分析

采用MS822野生株作为对照的Co-IP和LC-MS/MS分析结果显示，SURFIN4.1蛋白N端与茂氏点定位蛋白膜相关联组氨酸富含蛋白(membrane associated histidine-rich protein, MAHRP-1)相互作用。同时，SURFIN4.1蛋白N端与pRBCs表面蛋白PIESP2，Early transcribed membrane protein 10.2和Pf113，棒状体颈部蛋白RAP3，恶性疟原虫PVM转运子PTEX复合体成员-EXP2，伴侣蛋白HSP60相互作用(表1)。

3 讨 论

恶性疟原虫侵袭后向pRBCs胞浆输出的大量原虫蛋白为其红内期生长和发育提供基础。尽管大部分输出蛋白N端含PEXEL(PEXEL positive proteins)跨PVM膜转运序列，仍有一些恶性疟致病性相关输出蛋白属于PNEPs(PEXEL negative proteins)蛋白家族，如MCs定位的I型跨膜蛋白-SURFIN4.1。因此，本研究旨在通过分析SURFIN4.1蛋白氨基端(N端)在转运过程中的作用机制及其伴侣蛋白，为PNEPs蛋白转运机制的研究提供理论依据。

早期研究显示，内质网内的疟原虫天冬氨酸蛋白酶-plasmepsinV可水解输出蛋白N端的PEXEL序列，并乙酰化水解后残端“xE/Q/D”，进而介导输出蛋白穿越PVM上的PTEX转运子进入pRBCs胞浆[11-12]。本研究中，间接免疫荧光共定位研究结果显示，与含PEXEL序列的输出蛋白不同，SURFIN4.1蛋白的N端在转运过程中不经过进一步水解，即N端不断裂。这一结果与PfSBP1在恶性疟转运过程中的研究结果一致[13]，提示此机制可能普遍存在于PNEPs蛋白。

本研究首次检测了恶性疟原虫茂氏点定位蛋白SURFIN4.1蛋白N端在转运过程中的特性和其相互作用蛋白。实验结果显示，SURFIN4.1蛋白N端在转运中不经过水解过程，且在转运过程中与PVM转运子成员-EXP2、MCs定位蛋白、棒状体蛋白和多种pRBCs表面表达蛋白相互作用。本研究为恶性疟原虫PNEPs蛋白转运机制的研究提供理论依据。

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Functional Mechanism ofPlasmodiumfalciparumSURFIN4.1 Protein Amino (N) Terminal during Media-Induced Protein Transshipment

LIANG Yi-fan1, HE Yang2, CAO Ya-ming2, ZHU Xiao-tong2

(1. 98K7-Y-ProgramofReg.-and-Mast.Cont.Student,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122; 2.Teach. &Res.Div.ofImmun.,Coll.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

Plasmodiumfalciparum; SURFIN4.1；exported protein; PNEPs

国家自然科学青年基金项目(81301455)

梁怡凡 女，七年制在读。主要研究方向为抗感染免疫。E-mail：619752627@qq.com

* 通讯作者。女,副教授，博士，硕士生导师。主要研究方向为抗感染免疫。E-mail: xtzhu@cmu.edu.cn

2016-08-25；

2016-09-03

Q939.93;R382.3+1

A

1005-7021(2016)06-0076-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.013