分子标记技术及其在大麦遗传育种中的应用

余　 其，王振波，沈真辉，李应秋

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.福建省农科院作物研究所，福建 福州350000)



分子标记技术及其在大麦遗传育种中的应用

余 其#1，王振波#2，沈真辉1，李应秋1

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.福建省农科院作物研究所，福建 福州350000)

摘要：大麦是世界上栽培最古老的粮食作物之一，也是十分重要的饲料和酿酒原料。分子标记技术不受环境和季节限制，具有多态性高、信息量大、稳定性好等优势，已被广泛应用于大麦遗传育种。本文综述了分子标记主要类型、基本原理及优缺点，并介绍了近年来分子标记技术在大麦分子遗传图谱的构建、遗传多样性研究、种质资源鉴定、目标基因定位、起源与进化关系、分子标记辅助选择研究等方面的应用。

关键词：大麦；分子标记；遗传育种

大麦是世界上居于小麦、水稻、玉米之后的第4位重要的谷类作物，也是十分重要的饲料和酿酒原料[1]。大麦含纤维素、抗氧化成分，富含胆固醇生物合成抑制剂等，营养十分丰富，并且低糖低脂肪，在医疗保健食品开发等方面日益受到世界各国的重视。利用高产、优质、抗病的种质资源，创造大麦理想株型，突破产量屏障，开展大麦超高产优质育种，已成为近年来大麦育种家关注的热点。以前常规的育种方法已不能满足育种家的需要，近年来，分子标记通过提供准确、可靠、稳定的DNA水平的遗传标记，已在大麦遗传图谱的构建、遗传多样性研究、目标基因定位及起源关系进化研究等方面得到了广泛应用。

1分子标记特点及主要的分子标记

分子标记可直接反映生物体基因组DNA间的差异。分子标记很少受表现型影响，相对于形态学标记有如下特点：①不受环境及季节限制，不受试验材料部位的影响，而形态标记通常表达于特定的环境和一定的组织；②具有较高的遗传多态性，信息量大；③大多数标记为中性标记，群体的表型不会对其发生较大的改变；④显隐性互作情况不存在；⑤不受环境影响，同时也不存在上位效应[2]；⑥数量极多，遍及整个基因组；⑦大多分子标记能表现出共显性，可鉴定纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息；⑧同一套基因可以用于不同的物种[3]；⑨引物可随机设定，便于在物种中检出大量的DNA多态性；⑩操作简单快速。目前分子标记大致分为3大类型：①基于杂交的分子标记；②基于PCR的分子标记；③基于DNA序列和芯片的分子标记。

1.1 以分子杂交技术为基础的分子标记

限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，简称RFLP)是利用特定的限制性内切酶酶解基因组总的DNA，用特异性探针进行Southern杂交，通过放射自显影检测DNA多态性，该标记为共显性标记。RFLP的优点：①RFLP标记可靠性高；②具有共显性，可区分纯合和杂合；③无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；④遍布于整个基因组，在数量上几乎不受限制。RFLP应用很多，但也有一些缺点：①具有种属特异性，在实际应用中受到限制；②需要仪器设备较多，技术也较为复杂；③DNA需求量大(5～10μg)，纯度要求高；④多态性水平低。因此，RFLP应用受到一定限制。

1.2 以PCR技术为基础的分子标记

随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)标记的引物长度约10个碱基，先随机扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳检测DNA序列多态性。其优点是：①不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息，一套引物可用于不同生物的基因组分析；②无放射性，操作非常简单；③只需少量DNA 样品，对DNA质量要求不高；④引物没有严格的种属界限，具有广泛性和通用性。RAPD是显性标记，因此无法在F2代中鉴定基因型是纯合型还是杂合型。RAPD重复性差，PCR条件改变都会影响扩增结果。改善RAPD的反应体系，能在一定程度上提高RAPD的重复性。

扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)通过限制性核酸内切酶双酶切割基因组DNA，针对不同材料酶切片段差异，利用选择性碱基引物来进行PCR，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳来实现对产物的分离，通过放射性同位素的方法以及银染荧光染色获取目的图谱，并进行多态性判断。AFLP具有较高的分辨率，对模板纯度要求较高。产生的标记可覆盖整个基因组。AFLP多态性高，DNA用量少，它既有RFLP的可靠性，又有RAPD的高效性，但试验费用较高，操作难度大。尽管如此，AFLP是至今认为最有效的分子标记技术，在种质资源鉴定以及遗传多样性检测和物种亲缘关系分析中有着非常广泛的应用。

序列标签位点(Sequence tagged site，简称STS)是基因组上一段长度多在200～500bp之间的单拷贝短DNA上特定序列片段，这种序列通常会在染色体上只出现1次，利用1对寡聚核苷酸引物对基因组进行PCR，从而可以作为基因组中的特异位点，以此来判断DNA方向和其他特定序列的相对位置。STS的特点是操作简单，多态性好，信息量大。

简单重复序列多态性(Inter-simple sequence repeat，简称ISSR)，其原理是：在SSR序列基础上，在微卫星DNA序列的3′端或5′端加上2～4个随机核苷酸作为锚定引物，进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增的产物。ISSR标记为显性遗传，操作简单、快速、花费低，只需少量模板DNA，与SSR标记相比不需要知道靶序列的信息背景，结合了RAPD标记和SSR标记的优点，同时比以上标记更具多态性。然而，由于ISSR标记是显性标记，故未能计算杂合度与父系分析等问题，但ISSR技术快捷、经济、易操作，尤其适用于大批样品的研究。

序列特征化扩增区域(Sequence characterized amplified region，简称SCAR)由RAPD标记技术进一步发展而来。其原理是：通过对RAPD产物进行克隆与测序，在原RAPD引物的3′和5′端各添加14个碱基，来扩增其DNA片断，以产生多态性片断。SCAR标记克服了RAPD标记重复率差、可靠性低等缺点，不仅具有RAPD的显性特征，还可以将其显性特征转化为共显性。目前通过将RAPD标记转化为SCAR标记，可以大大提高试验准确率。

相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，简称SRAP)针对基因外显子中GC丰富,而启动子、内含子里AT丰富的特点来设计引物，它包括17个碱基的正向引物和18个碱基的反向引物，以对开放读码框进行扩增。因不同个体中内含子、外显子和其间隔长度不同而产生多态性。该标记特点是多态性高、重复性好、操作简单，引物具有通用性且引物合成成本较低。

简单重复序列(Simple sequence repeat，简称SSR)是由几个碱基组成的串联重复序列。由于重复序列的突变率较高，从而产生了很多等位基因，使SSR具有高度的多态性。SSR标记对DNA需求量少，质量要求低，容易检测，共显性遗传，多态性高，结果稳定可靠，重复性好，操作及分布于整个基因组，数量丰富，在遗传多样性研究、种质资源的鉴定、遗传图谱构建以及基因定位中有着广泛的应用。但是，SSR引物具有高度种属特异性，获得新SSR引物费用高，难度大。SSR富集文库的构建和SSR-EST的发展可以使SSR标记在大麦遗传育种中发挥更大的作用。

1.3其他新型分子标记

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，简称SNP)是由于单碱基的缺失、插入、转换和颠换而引起基因组水平上的DNA序列多态性。SNP标记位点分布广泛，同时遗传稳定性高以及具有检测快速、易实现自动化等特点。目前，SNP已成为生物学研究的热点。与其他类型的分子标记相比，SNP标记更适合数目庞大的检测分析。

多样性微阵列技术(Diversity arrays technology，简称DArT)，该技术依赖于微阵列芯片杂交的基础，一个阵列可同时检测分布在基因组中的几百个多态性位点。点阵列中每个点代表不同样本基因组的DNA片段，其中包括仅个别样本可具备的特异性片段。因不同样本的基因组DNA序列存在差异，故与芯片上同一点序列杂交的效率不一致，只有与探针DNA互补的点才具有杂交信号，在 DArT多样性分析中表现不同杂交信号强度或有无的点就是一个 DArT标记(DArT marker)，也是基因组代表中的一个多态性片段。DArT技术的主要优点是高通量低成本，缺点在于准确性不够高，重复性低，分辨率易受影响等，但其芯片制作、杂交、结果扫描和计算机分析的平台体系则有利于育种工作走向自动化与实用化，并可通过网络进行资源共享。

插入/缺失多态性标记(Insertion/deletion, 简称InDel)。该标记的多态性相对SSR要小，带型简单，分布较密，因此用于遗传分析或基因诊断的重现性、准确性和分辨率也大为提高，很适合遗传图谱的构建与基因定位分析。该标记在基因精细定位与染色体步移等多个领域具有较广阔的研究前景。

2分子标记在大麦遗传育种中的应用

2.1用于构建分子遗传图谱

分子遗传图谱是基因图位克隆、目标基因定位和分子标记辅助育种等研究的基础。图谱标记数多且分布均匀，那么基因定位就更精细[4]。大麦第1张分子标记遗传连锁图是Heun(1991)建立的，其群体为Proctor×Nudika杂交F1花药培养获得DH群体(共113株系)，包含157个RFLP标记[5]。此后，AFLP、SSR、STS、SNP、SRAP分子标记也逐渐被用于构建连锁遗传图谱。Prada等(2004)利用AFLP、SSR、STS农艺性状标记构建了包含147个标记的遗传图谱，其连锁群覆盖的总长为1 125 cM，标记的平均距离为7.5 cM[6]。Wenzl等(2004)以SSR、RFLP、STS和DArT标记构建了一张高密度遗传连锁图，并且把2 085个DArT整合到该图谱中[7]。郭蕾蕾(2012)利用SSR和SRAP标记筛选95对SSR标记和38对SRAP标记，共产生181个多态性位点，并构建连锁遗传图谱。该图谱包括102个SSR多态性位点及69个SRAP多态性位点，171个标记分布于全部7条大麦染色体上，分配到9个连锁群，总长度为1 424.2cM，标记间的平均距离为8.33cM[8]。孙红艳(2014)采用大麦耐镉性不同的亲本杂交F1构建DH群体为材料，利用SSR和SNP构建大麦遗传图谱，图谱总长度为369.9 cM，共包含56个标记，各个标记被定位于大麦7条染色体上，其中SSR标记41个，SNP标记15个，标记间平均距离为8.1cM[9]。Zhou等(2015)利用SNP标记构建遗传图谱，共有12 998个SNP标记被定位在7个连锁群，图谱总长度为967.6cM[10]。李媛媛等(2014)发现SRAP引物产生的多态性位点比SSR、AFLP多，SRAP更适合大麦遗传连锁图谱构建[11]。

2.2用于遗传多样性及种质资源鉴定

在大麦杂交育种中，选用遗传差异大的亲本对培育优良新品种具有重要意义。同时，根据遗传多样性结果对种质进行聚类分析，可以了解物种的系统发育、亲缘关系及起源。Russell等(1997)用RFLP、AFLP、SSR、RAPD 4种分子标记对18个栽培大麦的遗传多样性进行比较，发现SSR标记获得的多态性信息量最高[12]。Hou等(2005)利用RAPD和ISSR标记分析了中国西部16个大麦种质资源的遗传多样性，结果表明RAPD标记平均遗传相似系数为0.864，ISSR标记平均遗传相似数为0.674[13]。赵春燕等(2010)用42对SSR引物对42份大麦品种(系)的种质多样性及亲缘关系进行了分析，结果表明这些大麦基因型的遗传相似数的变化较小，且大麦地方品种遗传背景相对复杂[14]。赖勇等(2013)利用86个SSR标记对113份大麦亲本材料进行遗传多样性分析，检测出200个等位变异，遗传相似系数变异范围在0.550 4～0.989 7间，平均值为0.747 7[15]。Wang等(2014)利用71个SSR标记对99份大麦亲本材料进行遗传多样性分析，检测出184个等位变异。聚类分析表明，遗传相似系数范围从0.510 9～0.951 1，平均为0.720 2。根据遗传相似性系数可以将材料聚为5类。SSR标记的高多态性特点较其他分子标记更能揭示出作物遗传多样性[16]。

2.3用于重要性状基因定位

优良基因的鉴定和利用是大麦遗传育种的先决条件，分子标记技术的发展为定位大麦重要性状基因提供了一个有效的途径。Graner 等(1993)利用RFLP标记将抗大麦温型黄花叶病毒(BaMMV)基因定位在3H染色体长臂上[17]。Feng等(2004)将裸大麦分枝穗突变体(自发突变)中发掘的穗发育bm定位在大麦4H染色体短臂上[18]。张京(2003)通过SSR标记把我国大麦矮源品种所携带的基因uz定位在染色体3H上的HVM33和HVM60之间，遗传距离大约分别只有3.4cM和10.6cM[19]。Huang等(2011)将从多棱皮大麦分枝突变体(Prbs)中发掘的分枝穗发育Prbs基因定位在大麦3H染色体短臂上[20]。金婷将白化颖壳基因定位在3H上的Bmag0508A和Bmac0871之间，遗传距离分别为0.2cM和0.7cM[21]。对目标基因的定位和克隆可以进一步分析目标基因的功能。

2.4 用于阐明起源与进化关系

分子标记在作物的起源以及进化上的研究已非常成熟，目前该方面的报道较多。Melchinger等(1994)利用RFLP对欧洲大麦种质的48份春、冬大麦品种间的遗传多样性进行了分析，得出春大麦和冬大麦可以根据遗传相似系数划分为独立两组[22]。Ivandic(2002)等用图谱位置已知的33个SSR标记对来自以色列、土耳其和伊朗的39份野生大麦进行研究，发现大多数野生大麦能根据其起源的国家进行归类[23]。Feng等(2005)利用SSR标记西藏野生大麦的遗传多样性和地理分化进行相关研究，推测西藏野生二棱大麦可能是中国栽培大麦的祖先，进化关系为：野生二棱大麦→野生瓶形大麦→野生六棱大麦[24]。张镝(2007)等构建了36份西藏近缘野生大麦和4份栽培大麦的AFLP指纹图谱，发现近缘六棱大麦和栽培大麦亲缘关系更近，认为野生六棱大麦是栽培大麦进化的过渡类型[25]。

2.5用于分子标记的辅助选择

选择是作物育种的重要环节。通过连锁标记，间接性的选择作物目标性状，能够提高选择效率。大麦遗传育种中运用分子标记辅助选择的技术已经较为常见。Graner等(1999)通过CAPS标记和SSR标记分析了抗黄花叶病基因rym5，认为rym5是复合位点，鉴定的两侧分子标记MWG838和Bmac29，距该位点遗传距离分别只有0.8cM和1.3cM[26]。赵彦宏等(2011)利用Yd2基因紧密连锁的YLM、CAPS-Ylp、ASPCR-Ylp标记同时检测52份国内外大麦品种和4份大麦F1的Yd2基因型，可用于Yd2基因回交育种中的大规模标记辅助选择[27]。

3展望

分子标记应用研究快速发展，使得植物学分类和遗传多样性等方面的研究取得了重大成就。但是，我国的大麦分子标记育种技术还远远落后于国际水平，还需将常规育种与分子标记技术进行结合，才能够及时有效地发现并利用种质资源中的有利变异。同时，与我国的实际情况相结合，应将科研的重点放在大麦的品质与产量性状上，使我国的大麦育种技术在重点方向上不断取得进展。

参考文献：

[1]JENKINS G,顾千若译.大麦(综述)[J].麦类作物学报,1986(2).27-30.

[2]刘新芝,彭泽斌,傅骏骅，等.采用RAPD分子标记、表型和杂种优势聚类分析法对玉米自交系类群的划分[J].华北农学报, 1998(4):36-41.

[3]姜蔚.不同作物间EST-SSR标记的通用性及其应用研究[D].杨凌：西北农林科技大学,2009.

[4]冯宗云.分子标记在大麦遗传育种中的应用[J].大麦科学,2005(3):3-8.

[5]HEUN M,YKENNED A E, ANDERSON J A, et al.Construction of a restriction fragment length polymorphism map for barley [J]. Genome,1991,34:437-447.

[6]PRADA D,ULLRICH S E,MOLINACANO J L,et al.Genetic control of dormancy in a Triumph/Morex cross in barley[J]. Theoretical & Applied Genetics，2004,109(109):62-70.

[7]WENZL P,LI H B， CARLING J,et al. A high-density consensus map of barley linking DArT markers to SSR, RFLP and STS loci and agricultural traits[J]. BMC Genomics,2006,7:206.

[8]郭蕾蕾.大麦分子遗传图谱构建及其主要农艺性状和功能成分的QTL定位[D].成都：四川农业大学,2012.

[9]孙红艳.大麦耐镉及镉积累相关QTL定位与候选基因筛选及调控研究[D].杭州：浙江大学,2012.

[10]ZHOU G, ZHANG Q,ZHANG X Q,et al.Construction of high-density genetic map in barley through restriction-site associated DNA sequencing[J/OL]. Plos One, 2015, 10(7)[2015-07-16]. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0133161

[11]李媛媛,沈金雄,王同华,等.利用SRAP、SSR和AFLP标记构建甘蓝型油菜遗传连锁图谱[J].中国农业科学,2007, 4(6):1118-1126.

[12]RUSSELL J,FULLER J,YOUNG G,et al.Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs , AFLPs , SSRs and RAPDs [J] . Theoretical and Applied Genetics，1997, 95:714-722.

[13]HOU Y C,YAN Z H,WEI Y M,et al. Genetic diversity in barley from west China based on RAPD and ISSR analysis[J].Barley Genetics Newsletter,2005,35(1):9-22.

[14]赵春艳,曾亚文,普晓英,等.大麦基因型间SSR标记的多态性及其亲缘关系分析[J].麦类作物学报,2010,30(6):1011-1016.

[15]赖勇,王鹏喜,范贵强,等.大麦SSR标记遗传多样性及其与农艺性状关联分析[J].中国农业科学,2013,46(2):233-242.

[16]WANG J,WANG S H,LAI Y,et al.Genetic diversity and population structure analysis by using SSR markers in barley[J].Acta Agriculturae Nucleatae Sinica,2014,28(2):177-185.

[17]GRANER A,BAUER E.RFLP mapping of theym4 virus resistance gene in barley[J].Theoretical & Applied Gene-

tics，1993,86(6):689-693.[18]FENG Z Y,ZHANG L L,Zhang Y Z，et al.Chromosomal location of gene for earbranching of barley natural mutant “f151” using SSR markers[J].High Technology Letters,2004(2):5-8.

[19]张京.大麦矮秆基因uz的SSR标记[J].作物学报.2003,29(4):637-640.

[20]HUANG B G,WU W R.Mapping of mutant geneprbscontrolling poly-row-and-branched spike in barley (HordeumvulgareL. )[J].中国农业科学:英文版,2011,10(10):1501-1505.

[21]金婷.大麦白化颖壳突变体的遗传分析和基因定位[D].金华：浙江师范大学,2013.

[22]MELCHINGER A E,GRANER A.Relationships among european barley germplasm:I.Genetic diversity among winter and spring cultivars revealed by RFLPs[J].Crop Science, 1994,34(5):1191-1199.

[23]IVANDIC V,HACKETT C A，NEVO E,et al. Analysis of simple sequence repeats ( SSRs ) in wild barley from the Fertile Crescent : associations with ecology , geography and flowering time [J].Plant Molecular Biology,2002,48:511-527.

[24]冯宗云.中国野生及栽培大麦的分子进化与大麦穗分枝新基因的分子作图[D].成都：四川大学,2003.

[25]张镝,丁毅.基于AFLP标记的中国西藏近缘野生大麦遗传多样性分析[J].遗传,2007(6):725-730.

[26]GRANER A，STRENG S, KELLERMANN A,et al. Molecular mapping and genetic fine-structure of therym5 locus encoding resistance to different strains of the Barley Yellow Mosaic Virus Complex[J]. Theoretical and App-lied Genetics,1999,98(2):285-290.

[27]赵彦宏,王艳芳,李润植,等.利用分子标记鉴定大麦Yd2基因型及其在育种辅助选择中的应用[J].作物学报，2011(9):1683-1688.

Molecular Marker Technologies and their Applications to Barley Genetics and Breeding

YU Qi1, WANG Zhen-bo2, SHEN Zhen-hui1, LI Ying-qiu1

(1. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China.2. Crop Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350000, China)

Abstract:Barley is one of the most ancient crops cultivated in the world and also a very important feed grain and industrial material for beer brewing. In recent years, molecular marker technologies that can provide accurate and reliable DNA genetic markers have been widely applied to barley breeding and genetic studies. This review describes molecular markers in terms of their general characteristics, rationales, advantages, and disadvantages. This paper also illustrates the molecular marker technologies that have been applied to barley genetics and breeding research in recent years, particularly in barley genetic diversity, gene mapping, construction of genetic map, varietal identification, purity assessment, and marker-assisted selection.

Key words:Barley; Molecular marker; Genetics and breeding

收稿日期：2016-04-07

基金项目：国家自然科学基金项目(41460385)。

作者简介：#共同第一作者。余其 (1988—) ，女，硕士研究生，主要从事麦类植物分子遗传与育种研究。E-mail:18725187672@163.com。 王振波(1989—)，男，硕士研究生，主要从事植物资源的研究与利用。E-mail:754977774@qq.com。

中图分类号：S512.3；Q754

文献标识码：A

文章编号：1673-6486-20160174

网络出版时间：2016-05-05

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/32.1769.S.20160505.1137.001.html