乙酰葛根素对氧糖剥离致神经元损伤的干预作用

李 兰 刘东梅

安徽医学高等专科学校护理学部 安徽合肥 230601

乙酰葛根素对氧糖剥离致神经元损伤的干预作用

李 兰 刘东梅

安徽医学高等专科学校护理学部 安徽合肥 230601

本文主要通过三组实验来研究乙酰葛根素氧糖剥离对神经细胞损伤的干预作用。研究方法在氧糖剥离的基础上建立细胞模型；利用6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）法观察神经细胞的凋亡率；利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测细胞核因子（或称为K基因结合核因子）、蛋白质（HIF-1α）以及P53基因的表达；利用蛋白印迹法或免疫印迹的实验方法测定热休克蛋白70（Hsp70）的含量以及三种不同浓度的乙酰葛根素对热休克蛋白70的影响。

乙酰葛根素；氧糖剥离；热休克蛋白

脑中风又被称为脑卒中或脑血管意外是一种急发的高死亡率的病症，病因是脑部血液循环障碍而引起的大脑局部功能缺失导致细胞死亡，其细胞的死亡有凋亡和坏死这两种形式。缺血性脑中风中心区的细胞死亡是由细胞坏死导致的，而中心区周围的细胞死亡是由细胞凋亡而导致的[1]。凋亡的细胞，如果不及时供血一般在数小时或几周内将会死亡，如果供血及时凋亡的细胞会因血供恢复而得到复苏。因此，如果能研制出具有保护脑缺血功能的药物就能够有效降低缺血导致的神经元的凋亡率，从而降低因脑中风而导致的死亡率[2-3]。乙酰葛根素是对葛根中提炼出的葛根素进行改造化学结构引入侧链后得到的一种新型异黄酮类化合物其结构，相对葛根素其脂溶性增加，透过血脑屏障的能力明显提高。

实验中，我们采用国内外常用的体外氧糖剥离模型，研究乙酰葛根素对胎鼠海马神经细胞凋亡起到的保护作用，并对影响机制进行探讨。

1 实验方法

1.1 进行胎鼠海马神经细胞的培养

完全培养液为神经基质培养基（NB）、1.2摩尔/L的谷酰胺、蛋白基因B27（20 ml·）、青霉素（50 k U·）以及链霉素（50 mg·）。试验开始后间隔3天换一次溶液，到第7天或者第八天开始后续实验。每组实验均需重复 3 次，所用胎鼠海马神经细胞要来自于 3 只不同的孕鼠。

1.2 氧糖剥夺及分组

正常对照组：换成含糖酚红液，置入二氧化碳培养箱，三小时后换成神经基质培养基完全培养液孵育（不含蛋白基因）。氧糖剥夺/R-24 h 组：最先将无糖酚红液滴入厌氧培养箱中半小时，氧的浓度保持低于1%。用无糖酚红液对细胞进行4次清洗，每次使用的无糖酚红液为原培养液体积的 2/3，葡萄糖的浓度保持低于1摩尔/L。细胞在厌氧罐内放置三小时后换神经基质培养基完全培养液（不含蛋白基因），然后放入二氧化碳培养箱内继续进行一天的孵育。药物处理组：在换无糖酚红液及氧糖剥夺结束后换成神经基质培养基完全培养液（不含不含蛋白基因）时，分别在三组胎鼠中加入低、中、高不同浓度浓度的乙酰葛根素，低浓度为 0.1摩尔/L、中浓度为0.4摩尔/L、高浓度为1.6摩尔/L，其余处置同上。

1.3 6-联脒-2-苯基吲哚检测

加入 2.5摩尔/L的6-联脒-2-苯基吲哚染料，使用荧光显微镜进行观察。如果染色较亮，染色质浓缩，甚至出现碎裂的细胞就是凋亡样的阳性细胞。凋亡细胞的计算方法在显微镜观测下随机所选取5个阳性细胞数占总计数的百分率。

1.4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

实验过程可参照试剂盒的说明进行。结果采用阿尔法缓解俱乐部软件进行分析，用目标产物与肌动蛋白的光密度比值来表示各组信使核糖酸的水平。

1.5 利用免疫印迹法使神经细胞经RIPA裂解，

十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后在半干状态下转运至聚偏氟乙烯膜上，加热激蛋白70山羊抗一抗（1∶400），过夜温度保持在4℃，加入二抗（1∶5000），利用化学发光法使其显色。

2 ．结果

2.1 乙酰葛根素对氧糖剥离/R-24 h 导致的细胞凋亡率的影响

氧糖剥夺的海马神经细胞显示有凋亡细胞的出现，试验中采用低浓度0.1摩尔/L、中浓度0.4摩尔/L、高浓度为1.6摩尔/L的乙酰葛根素，低浓度的乙酰葛根素使凋亡的阳性细胞的数目降至63.01% ±7.35%、中浓度的将至 59.06% ±5.98%、高浓度的将至 51.05% ±5.98%。根据三次实验结果显示出中和高浓度的乙酰葛根素对氧糖剥夺/R-24 h导致的神经细胞有保护作用（P＜ 0.05）。

2．2 乙酰葛根素对氧糖剥夺/R-24 h 所致的核转录因子、缺氧诱导因子以及p53信使核糖酸表达的影响

核转录因子在脑细胞缺血以及再灌注中的具体作用还存有异议。在本次实验中，不同浓度的乙酰葛根素可以使已经升高的核转录因子以及信使DNA降低。缺氧诱导因子以及信使核糖酸在海马神经细胞的凋亡中发挥着至关重要的作用，乙酰葛根素可使氧糖剥夺/R-24 h 后升高的缺氧诱导因子及p53信使核糖酸水平降低。

2.3 乙酰葛根素对氧糖剥夺/R-24h所致热休克蛋白70表达的影响

热休克蛋白70是一种高度保守的蛋白，会随着脑细胞缺血而升高，能够对受损海马细胞起到保护作用。为了观测乙酰葛根素的神经细胞保护作用是否会关系到热休克蛋白70的改变，我们通过蛋白质印迹法检测了各组胎鼠海马神经细胞热休克蛋白70 的表达。氧糖剥夺/R-24 h后热休克蛋白70的表达值保持在0.23±0.08，分别加入低、中、高浓度的乙酰葛根素后，对应的表达值为低浓度0.49±0.16、中浓度0.73±0.08、高浓度1.11±0.24，加入前后具有显著的差异。

通过对三组胎鼠海马神经细胞的实验，可得出以下结论 不同浓度的乙酰葛根素能够使热休克蛋白70有很明显的升高，能够增强机体海马神经元对缺血损伤的抵抗能力。综上所述，乙酰葛根素对体外氧糖剥离的神经细胞具有保护作用，保护机制涉及到相关凋亡因子的改变。

[1]宋修云，胡金风，陈乃宏．神经细胞凋亡与脑缺血疾病［J］．中国药理学通报，2012，28（3）：307 - 10．

R285.5

A

1672-5018（2016）07-037-01

安徽省高校自然科学研究一般项目（编号：12925KJ2015B06）