酶联免疫斑点试验对肺结核诊断的临床价值

陈大川，王在义

(新疆医科大学第一附属医院呼吸二科，新疆 乌鲁木齐 830054)

酶联免疫斑点试验对肺结核诊断的临床价值

陈大川，王在义

(新疆医科大学第一附属医院呼吸二科，新疆 乌鲁木齐 830054)

目的 探讨酶联免疫斑点试验(ELISPOT)在肺结核临床诊断中的应用价值。方法回顾性分析2013年12月至2014年12月入住新疆医科大学第一附属医院符合本研究条件的患者172例，根据诊断标准将其分为肺结核组96例(其中确诊组18例，临床诊断组78例)，肺炎组76例，两组患者均进行ELISPOT、胸部CT检查，部分患者行TB-DNA、TB-Ab、痰涂片检查，分析和比较ELISPOT的诊断价值。结果96例肺结核患者中92例ELISPOT阳性，76例肺炎患者中67例ELISPOT阴性，其灵敏度95.83%，特异度88.16%，阳性似然比7.44，阴性似然比0.05，阳性预测值91.09%，阴性预测值94.37%，约登指数0.84，Kappa值0.85。肺结核组与肺炎组患者的ELISPOT比较差异有统计学意义(P＜0.05)。ELISPOT检查结果显示，确诊组阳性率为94.44%，临床诊断组阳性率为96.15%，两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。ELISPOT灵敏度均高于TB-DNA、TB-Ab、痰涂片、胸部CT，差异有统计学意义(P＜0.05)。ELISPOT特异度与TB-DNA、TB-Ab比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但高于胸部CT，低于痰涂片，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论ELISPOT较高的灵敏度及特异度可以成为临床诊断活动性肺结核的有效工具，较高的阴性预测值对排除活动性肺结核有重要参考价值。

肺结核；临床诊断；酶联免疫斑点试验

肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)是一种慢性呼吸系统传染病，病原菌为结核分枝杆菌，主要通过空气-飞沫传播，结核杆菌常侵犯肺脏而导致肺结核，另外也可引起其他器官的结核病(如肠、肾、骨、脑等)，因其传染性强，可侵犯损害多器官，严重威胁着人类生命，曾被称为“白色瘟疫”，随着抗结核药的问世，结核病的治愈率达95%以上[1]。近年来因耐药菌增加、人口密集等原因，肺结核的患病率呈现升高趋势，因而如何快速、有效地诊断该疾病成为临床研究的重点。我院近年来开展了酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot test，ELISPOT)研究，旨在探讨其在肺结核诊断中的临床价值，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年12月至2014年12月入住新疆医科大学第一附属医院呼吸科且符合本研究条件的患者172例，其中肺结核96例，男性50例，女性46例；年龄17～79岁，中位年龄49.50岁；涂阳13例，病检阳性6例（其中涂阳+病检阳性1例）。肺炎76例，男性46例，女性30例；年龄16～79岁，中位年龄44.50岁；痰细菌培养阳性10例。按照诊断标准将肺结核患者分为确诊组18例(经痰涂片镜检或组织病理学检查确诊)，临床诊断组78例(全部病例经抗结核治疗有效)。

1.2 纳入标准

1.2.1 肺结核组 符合下列项目任何一条者纳入肺结核组[2]：(1)胸部影像学检查见活动性肺结核表现+典型的肺结核临床表现(咳嗽、咳痰、胸痛、咯血及潮热、盗汗、乏力、纳差等结核中毒症状)；(2)胸部影像学检查见活动性肺结核表现+结核菌素试验为强阳性；(3)胸部影像学检查见活动性肺结核表现+结核抗体等其他辅助检查阳性；(4)胸部影像学检查见活动性肺结核表现+肺外其他组织病检证实为结核者；(5)疑似肺结核者经诊断性抗痨治疗或随访观察能排除其他肺部病变者。

1.2.2 肺炎组 符合第(5)条和(1)～(4)条中任何一条者纳入肺炎组[3]：(1)发热，体温≥38°C；(2)新近出现咳嗽、咳痰症状，或原有症状加重，同时出现脓痰，可伴有胸痛；(3)肺部有实变体征及湿啰音；(4)白细胞(WBC)＞10×109/L，中性粒细胞绝对值和百分比增高，可有核左移；(5)胸部影像学检查显示新出现或呈进展性的肺部浸润性阴影或间质性改变，可伴胸腔积液。

1.3 排除标准 (1)年龄＜16岁的未成年人、妊娠妇女；(2)复发性肺结核、肺外结核、严重肝肾功能障碍者、获得性人类免疫缺陷病毒感染者、肿瘤患者、糖尿病人；(3)已经在使用糖皮质激素、免疫抑制剂/增强剂、行放化疗或抗结核治疗的患者；(4)与开放性肺结核患者密切接触者；(5)未签署抗结核治疗知情同意书的患者。

1.4 方法

1.4.1 ELISPOT 采集样本后分离外周血单个核细胞(PBMCs)，并进行细胞计数，配制每100µL含有25万个细胞的标准溶液；在微孔板条上按空白对照孔、测试孔A、测试孔B、阳性对照孔的方式排列，然后分别加入50 μL细胞培养液至空白对照孔内，50µL抗原A(ESAT-6)溶液至测试孔A内，50µL抗原B (CFP-10)溶液至测试孔B内，50 μL植物血凝素至阳性对照孔内；在37℃保持湿润的含有5%的CO2培养箱中孵育16～20 h，然后从培养箱中取出培养板弃去细胞培养液，每个反应孔内加入200µL磷酸盐缓冲液(PBS)，随后弃去PBS，再用新鲜的PBS重复洗涤至少3遍；用PBS 200倍稀释浓缩标记抗体试剂，每个反应孔内加入50µL标记抗体工作液，2℃～8℃孵育1 h，弃去标记抗体工作液，再按上述步骤洗涤；每个反应孔内加入50 μL底物显色溶液室温孵育7 min，用蒸馏水彻底洗涤培养板终止反应，计数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点。

1.4.2 TB-DNA 患者晨起后用清水漱口，收集其咳出的深部痰液(痰量1～5 mL)于无菌痰盒中，送至检验科后经痰标本、阴性对照品、阳性对照品、扩增试剂制备及PCR扩增等程序处理，并设定检测通道(FAM和HEX或VIC通道)，选择荧光采集点为60℃30 s，再根据分析后图像调整基线和阈值线，最后得出结果。

1.4.3 TB-Ab 使用采血管采集患者静脉血，送至检验科分离血清标本并立即检测或在4℃保存48 h内完成检测；检验人员撕开铝箔袋，取出检测卡平放，登记标本号，向加样孔中加入30µL血清标本，再滴加50～100µL(2～3滴)缓冲液，计时15 min观察结果。

1.4.4 痰涂片镜检 患者入院后收集其即时痰、夜间痰、次日晨痰(痰液量3～5 mL)进行萋-尼(Ziehl-Neelson)染色法检查，操作流程严格按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》执行；痰标本被送至检验科后医务人员小心打开痰盒，使用棉签挑取痰液中干酪样、脓样或可疑部分约0.05 mL，在玻片正面均匀涂抹形成卵圆形痰膜，待涂片自然干燥后放置在染色架上，加热固定后行萋-尼染色，最后将干燥的染色玻片置于显微镜下观察并计数抗酸杆菌。

1.4.5 胸部CT 患者在吸气状态下CT常规从肺尖扫描至横膈水平，层厚5 mm，层距5 mm，部分患者根据病情需要行1 mm薄层扫描或使用高压注射器团注造影剂(碘海醇注射液或碘比醇注射液，注射流率为3 mL/s，注射剂量为100 mL)行增强扫描，将所采集的图像传输到PACS系统，然后进行图像后处理。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料呈偏态分布以中位数和四分位数间距(median，IQR)表示，两组间比较采用非参数秩和检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验或fisher概率确切法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺结核组与肺炎组间ELISPOT诊断效能比较 96例肺结核患者的ELISPOT结果显示，92例阳性，4例阴性，灵敏度为95.83%，漏诊率(假阴性率)为4.17%。76例肺炎患者的ELISPOT结果显示，9例阳性，67例阴性，特异度为88.16%，误诊率(假阳性率)为11.84%。阳性似然比7.44，阴性似然比0.05。阳性预测值91.09%，阴性预测值94.37%。约登指数(Youden) 0.84。Kappa值为0.85。此外，ELISPOT在肺结核组与肺炎组间诊断效能比较，差异有统计学意义(χ2= 123.45，P＜0.05)。

2.2 确诊组与临床诊断组ELISPOT试验阳性率的比较 肺结核组患者行痰液或支气管吸出物涂片抗酸染色检查结果阳性13例，经皮肺穿刺活检或经支气管镜下肺组织活检结果阳性6例，包括1例菌阳+病检阳性，故确诊组共18例，其中ELISPOT试验结果阳性17例，阴性1例，阳性率为94.44%，临床诊断组78例，其中ELISPOT试验结果阳性75例，阴性3例，阳性率为96.15%。对两组患者ELISPOT阳性率进行比较，经Fisher概率确切法计算，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 肺结核组所使用的五种检测方法灵敏度比较 ELISPOT灵敏度为95.83%，均高于TB-DNA、TB-Ab、痰涂片、胸部CT灵敏度，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 肺结核组五种检测方法灵敏度比较（例）

2.4 肺炎组五种检测方法特异度比较 ELISPOT特异度为 88.16%，与 TB-DNA、TB-Ab特异度(95.24%、92.59%)比较差异无统计学意义。胸部CT特异度为71.05%，显著低于ELISPOT，差异有统计学意义。痰涂片特异度为100.0%，高于ELISPOT，差异有统计学意义，见表2。

表2 肺炎组五种检测方法特异度的对比（例）

2.5 ELISPOT试验的ROC曲线分析 绘制ELISPOT试验的ROC曲线，曲线下面积为0.93，标准误为0.02，95%置信区间(confidence interval，CI)0.88～0.97，表示该试验诊断效能好，见图1。

图1 ELISPOT试验的ROC曲线

3 讨 论

人体在初次感染结核杆菌后会产生致敏T淋巴细胞，并可以转化为记忆T淋巴细胞，当机体再次感染结核杆菌时，记忆T淋巴细胞会转变为效应T淋巴细胞并释放出多种细胞因子，其中包含有临床诊断意义的γ-干扰素[4-5]，根据这种原理利用结核杆菌特异抗原(早期分泌抗原靶6和培养滤液蛋白10)刺激机体效应T淋巴细胞释放γ-干扰素并采用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)来检测分泌γ-干扰素的效应T淋巴细胞的数量[6-7]，以此来判断机体是否感染结核杆菌，因为检测的是细胞数量，不受细胞因子代谢的影响，故而可以比较真实地反映体内的感染情况。该技术已在2004年被英国 Oxford Immunotec公司制作成ELISPOT试剂盒并应用于临床，该试剂盒于2008年被美国食品及药物管理局(FDA)认证并写入欧美发达国家结核诊疗指南中。

本研究结果显示ELISPOT的灵敏度为95.83%、特异度为88.16%，漏诊率为4.17%、误诊率为11.84%，阳性似然比为7.44，阴性似然比为0.05，阳性预测值为91.09%，阴性预测值为94.37%，约登指数(Youden)为0.84。痰涂片阳性13例，除1例阴性外，其余患者的ELISPOT均为阳性，出现阴性结果者考虑与其自身体质较弱影响细胞免疫功能有关。以上结果说明ELISPOT对肺结核的辅助诊断效能好，与国内外相关文献报道相似[8-12]，但是该试验不能区别潜伏性结核和活动性结核[13]；Kappa值为0.85，说明ELISPOT与金标准具有极好的一致性。此外，肺结核组3例患者临床表现为咳嗽、咳痰、胸闷、气短等不典型症状，胸部CT示肺部阴影、实变、肺炎征象，但ELISPOT结果均为阳性，经支气管镜检查后确诊1例支气管内膜结核，2例肺结核合并支气管结核，该结果提示ELISPOT试验结合支气管镜检查可以提高对支气管结核的诊断率。确诊组与临床诊断组ELISPOT试验阳性率分别为94.44%、96.15%，差异无统计学意义；确诊组包含部分涂阳肺结核，临床诊断组均为涂阴肺结核，试验结果提示ELISPOT检测效能与患者是否排菌或排菌量大小无关，因此可以降低肺结核漏诊率，对菌阴肺结核的诊断也有重要价值。

本研究结果显示ELISPOT的灵敏度(95.83%)显著优于TB-DNA(28.00%)、TB-Ab(16.22%)、痰涂片(18.31%)、胸部CT(53.13%)，且差异有统计学意义；ELISPOT的特异度(88.16%)优于胸部CT(71.05%)，差异具有统计学意义，与痰涂片(100.00%)比较有较小差异(0.01＜P＜0.05)，与TB-DNA(95.24%)、TB-Ab (92.59%)差异无统计学意义。因此，本研究结果表明，ELISPOT试验对肺结核的诊断效能明显优于其他结核诊断方法。受试者工作特征曲线(ROC曲线)是评价试验诊断效能的重要指标，曲线折角(截断值)越靠近左上角，曲线下的面积越大，表明试验的灵敏度和特异度均好，漏诊率和误诊率也小；本研究计算出ELISPOT试验的ROC曲线下面积为0.93，与刘琳等[14]研究报道的结果基本一致(ROC曲线下面积为0.936)。

综上所述，ELISPOT较高的灵敏度及特异度可以成为临床上活动性肺结核辅助诊断的有效工具，较高的阴性预测值对排除活动性肺结核有重要参考价值。

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Clinical value of enzyme-linked immunospot test in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.

CHEN Da-chuan, WANG Zai-yi.Department of Respiratory Medicine,the First Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the value of the enzyme-linked immunospot test(ELISPOT)in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.MethodsA total of 172 cases of patients with respiratory disease,who admitted to the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from December 2013 to December 2014,were retrospectively analyzed,and were divided into the tuberculosis group(96 cases,including18 cases of confirmed group and 78 cases of clinical diagnosis group)and the pneumonia group(n=76)according to the diagnostic standard.ELISPOT and chest CT were carried out in the two groups.TB-DNA,TB-Ab and sputum smear microscopy were carried out in some patients of the two groups.The diagnostic value of ELISPOT was compared and retrospectively analyzed.ResultsNinety-two cases of the 96 pulmonary tuberculosis patients were positive in ELISPOT,and 67 cases of the 76 pneumonia patients were negative in ELISPOT,with sensitivity of 95.83%,specificity of 88.16%,positive likelihood ratio of 7.44,negative likelihood ratio of 0.05,positive predictive value of 91.09%,negative predictive value of 94.37%,Youden index of 0.84,and Kappa value of 0.85.The difference of ELISPOT between the tuberculosis and the pneumonia group was significant(P＜0.05).There was no significant difference between the confirmed group(94.44%)and the clinical diagnosis group (96.15%)in the positive rate(P＞0.05).The sensitivity of ELISPOT was significantly higher than that of TB-DNA, TB-Ab,sputum smear microscopy,chest CT(P＜0.05).The specificity of ELISPOT was significantly higher than that of chest CT,and significantly lower than that of sputum smear microscopy(P＜0.05),but there was no significant different with TB-DNA and TB-Ab(P＞0.05).ConclusionELISPOT can be an effective tool for the diagnosis of pulmonary tuberculosis with good sensitivity and specificity.High negative predictive value has important reference value for excluding active pulmonary tuberculosis.

Pulmonary tuberculosis;Clinical diagnosis;Enzyme-linked immunospot assay

R521

A

1003—6350（2016）20—3316—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.016

2016-03-18)

王在义。E-mail：wangzaiyi@medmail.com.cn