丙泊酚对老年大鼠认知功能及海马区nNOS、血清β-淀粉样蛋白的影响

张焕，苑韬，时艳杰

(辽宁中医药大学附属医院麻醉科沈阳医学院附属第三医院麻醉科，辽宁 沈阳 110032)

丙泊酚对老年大鼠认知功能及海马区nNOS、血清β-淀粉样蛋白的影响

张焕，苑韬，时艳杰

(辽宁中医药大学附属医院麻醉科沈阳医学院附属第三医院麻醉科，辽宁 沈阳 110032)

目的 探讨丙泊酚对老年大鼠学习记忆及认知能力的影响及其可能的机制。方法选择30只12个月龄SD大鼠，按分层随机区组法随机分为三组，每组10只，即训练组、丙泊酚低剂量组和高剂量组。麻醉结束后24 h，采用不固定训练次数随机法连续5 d进行水迷宫的行为学测试：记录各组的逃避潜伏期、穿越平台次数。测试结束抽取大鼠血后立即断头取脑，采用免疫组化染色法检测大鼠海马区脑组织nNOS的表达情况及大鼠血清中β-淀粉样蛋白含量。结果12个月龄SD大鼠丙泊酚麻醉后各组同时段水迷宫行为学测试的结果显示：高剂量组与训练组比较，逃避潜伏期显著延长、穿越平台次数显著减少，差异有统计学意义(P＜0.01，t=12.142、5.63)；低剂量组与训练组比较，差异无统计学意义(P＞0.05，t=0.386、0.773)。免疫组化染色的结果显示：高剂量组海马区nNOS阳性细胞数和积分光密度值(IOD)明显低于低剂量组和训练组，差异有统计学意义(P＜0.01，t=12.072、11.646)；低剂量组与训练组比较，两项指标差异无统计学意义(P＞0.05，t=0.642)。高剂量组与低剂量组、训练组比较，血清β-淀粉样蛋白含量增多，差异有统计学意义(P＜0.01，t=11.692、10.354)；低剂量组与训练组比较，两组血清β-淀粉样蛋白含量比较，差异无统计学意义(P＞0.05，t=0.082)。结论多次高剂量丙泊酚注射麻醉诱导及维持对老年大鼠的学习记忆与认知功能损害与海马区nNOS表达的抑制程度和血清β-淀粉样蛋白含量有关。

丙泊酚；老年大鼠；认知功能；一氧化氮合酶；β-淀粉样酶

近年来的动物实验研究表明，持续应用某些全身静脉麻醉药物能够对动物的学习记忆和认知功能产生不良影响，发生术后认知功能障碍(POCD)。通过临床观察和循证医学调查，老年患者全身麻醉后发生POCD的比例相对较高[1]，目前多数学者认为大脑海马区中的神经元型一氧化氮合酶(Neuron nitric oxide synthetase，nNOS)可能参与了学习记忆的重要环节和过程，同时nNOS又是合成神经递质一氧化氮(Nitric oxide，NO)的关键酶[2]。由于淀粉样蛋白(Aβ)是神经系统损伤和持续性炎症反应的潜在标志物之一，因此还有学者认为POCD与麻醉药物的使用和其引起β-淀粉样蛋白的表达有关[3]。本实验在建立丙泊酚麻醉动物模型的基础上，通过Morris水迷宫进行神经行为学测试，观察丙泊酚对老年大鼠空间学习记忆及认知功能的影响，同时采用免疫组化方法及测定大鼠血清中β-淀粉样蛋白含量，为探讨丙泊酚麻醉后老年大鼠空间学习记忆及认知能力变化的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及麻醉方法 正式实验前采用Morris水迷宫预先对所有大鼠进行游泳试验，以淘汰先天运动功能障碍的大鼠。所有实验大鼠由辽宁中医药大学动物实验中心提供。选用通过测试的健康清洁级SD大鼠30只，体质量(291.26±9.41)g，12个月龄、雌雄各半。实验前1 d使所有大鼠自由摄食饮水并熟悉实验室环境。按分层随机区组设计分为三组，每组10只：训练组、低剂量组和高剂量组。训练组大鼠予以腹腔注射0.9%氯化钠注射液2 mL，对低剂量组实施麻醉诱导时给予腹腔注射1%丙泊酚(捷力康英国)50 mg/kg，高剂量组大鼠实施麻醉诱导时给予腹腔注射1%丙泊酚(捷力康英国)100 mg/kg，麻醉维持期间分别每小时追加首次剂量的半量并持续6 h。所有大鼠每次腹腔注射相应实验剂量的药物后立即放入吸氧箱内，持续吸入纯氧，流量5 L/min。翻正反射完全恢复正常后，立即从吸氧箱中取出大鼠完成动物模型的建立。麻醉期间用脉搏血氧饱和度监护仪的探头贴于大鼠腹部持续监测脉搏氧饱和度，以防麻醉过深导致的大鼠缺血缺氧性脑损害对实验结果产生影响。

1.2 动物行为学测试 连续用药6 d后以Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)进行学习记忆功能测试，实验前，将平台置于水迷宫东北象限中央，没于水下2 cm，水池内加入适量墨汁，使大鼠无法识别平台，在迷宫池壁外粘贴几件物体作为参照物，将水温加热至24°C～26°C。定位航行实验设定为5 d，每天固定分上下午两个时间段，每时间段分别训练4次。将大鼠分别从不同象限把动物放入水中，利用秒表记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，每次间隔时间设定为1 min。第5天下午施行空间探索实验，移出平台，将大鼠从西南象限放入水中，用摄像机记录2 min内动物在迷宫中的游泳路径并记录穿越平台位置次数作为记忆成绩。

1.3 神经型一氧化氮合酶检测 学习记忆能力测试结束后立即抽取各组大鼠血3 mL，以3 000 r/min离心5 min，吸取血清置于-30°C待测。再以4%多聚甲醛预灌注后断头取脑，采用免疫组化SP法对各组大鼠海马组织中的nNOS进行检测。常规制备石蜡切片后，脱蜡至水化，再采用微波法进行抗原修复，分别依次滴加3%H2O2，山羊血清，一抗(1:500稀释)4℃孵育过夜，二抗，37℃孵育1h，滴加DAB显色液进行显色，苏木素复染，中性树胶封片后，在数码显微镜下采集照片，应用Leica Q550CW图象采集和分析系统，取每只大鼠海马区3张切片进行镜下(40×10)观察，选取每张切片5个互不重叠的视野，测定其单位面积阳性细胞表达的光密度值，分别采集5个视野的平均光密度值作为本实验数据以反映nNOS阳性表达情况。

1.4 淀粉样蛋白含量检测 采用酶联免疫吸附(ELISA)法分别检测各组待测大鼠血清，测定血清中的淀粉样蛋白含量，检测方法严格按照试剂盒中说明书进行。

2 结 果

2.1 各组逃避潜伏期、穿越平台次数比较 高剂量组与训练组相比，逃避潜伏期显著延长、穿越平台次数显著减少，差异有统计学意义(P＜0.01)；低剂量组与训练组相比，两项指标差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 各组大鼠水迷宫结果(±s)

表1 各组大鼠水迷宫结果(±s)

注：高剂量组与训练组比较(高剂量组与训练组逃避潜伏期at=12.142，高剂量组与训练组空间探索at=5.63)，aP＜0.01。低剂量组与训练组比较(低剂量组与训练组逃避潜伏期bt=0.386，低剂量组与训练组空间探索bt=0.773)，bP＞0.05。

组别 只数 逃避潜伏期(s)空间探索(穿越平台次数)训练组低剂量组高剂量组10 10 10 1.900 0±1.042 68a2.100 0±1.261 88b21.200 0±4.917 09a6.200 0±1.635 29a6.800 0±1.829 27b2.500 0±1.281 14a

2.2 各组海马区nNOS阳性细胞和积分光密度值(IOD)比较 免疫组化染色的结果显示：高剂量组海马区nNOS阳性细胞数和积分光密度值(IOD)明显低于训练组和低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.01)；而低剂量组与训练组比较，两项指标差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 各组大鼠海马组织中nNOS平均光密度(±s)

表2 各组大鼠海马组织中nNOS平均光密度(±s)

注：高剂量组与训练组比较(t=12.072)，aP＜0.01，高剂量组与低剂量组比较(t=11.646)abP＜0.01，低剂量组与训练组比较(t=0.642)，bP＞0.05。

组别 只数NOS训练组低剂量组高剂量组10 10 10 0.376 8±0.059 93a0.362 1±0.040 63b0.135 7±0.019 93a

2.3 各组血清β-淀粉样蛋白含量比较 高剂量组与低剂量组和训练组比较，血清β-淀粉样蛋白含量增多，差异有统计学意义(P＜0.01)低剂量组与训练组相比，两项指标差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3

表3 各组大鼠血清中Aβ含量(±s)

表3 各组大鼠血清中Aβ含量(±s)

注：高剂量组与训练组比较，t=11.692，aP＜0.01，高剂量组与低剂量组比较，t=10.354，P＜0.01，低剂量组与训练组比较，t=0.080，bP＞0.05。

组别 只数 淀粉样蛋白(Aβ，pg/mL)训练组低剂量组高剂量组10 10 10 28.926 7±7.933 57a29.219 3±8.402 87b168.97±36.933 57a

2.4 各组海马组织免疫组化染色检测 免疫组织化学染色结果显示，附着于神经细胞膜的褐色颗粒为阳性表达产物，高剂量组阳性表达产物明显低于训练组和低剂量组，见图1。

图1 丙泊酚对各组大鼠海马区nNOS表达的影响(40×10)

3 讨 论

POCD是指受多种因素影响的麻醉手术后患者发生记忆力、定向力、抽象思维等障碍的急性神经系统综合征，高龄是最为重要的危险因素，有研究表明老年患者术后认知功能障碍的发生率高达30%左右[4]。POCD的病理机制目前尚不明确。有学者认为其与阿尔茨海默病(AD)的发生可能有共同的病理基础[5]：其基本的病理学特征为中枢胆碱能系统功能降低、神经元纤维缠结和β淀粉样蛋白聚集[6-7]。

学习记忆的重要解剖学基础与中枢神经系统相关，特别是与大脑边缘系统的重要组成部分—海马关系密切[8]。海马区中合成神经递质一氧化氮(NO)进而参与学习记忆的关健酶是神经型一氧化氮合酶(nNOS)；同时大多数学者认为，学习记忆的神经生理学基础是大脑海马部位突触传递效能的长时程增强与放大现象(Long-term potentiation，LTP)[9-10]；还有动物实验研究表明，有些麻醉镇静药导致学习记忆及认知功能受损是恰恰是通过激活神经中枢抑制性递质—氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)受体，从而抑制离体海马脑片的长时程增强与放大效应，并使突触传递的可塑性受到严重影响，进一步引起nNOS表达下降所致[11]。

Aβ是AD细胞核中老年斑的始动因子和主要成分，在大脑Aβ增多与认知功能障碍关系密切[12]，Aβ可以导致神经元间信息传递受阻，并引发神经细胞凋亡，从而引起学习记忆障碍。Aβ表达不仅可致神经元突触功能障碍，还可通过蛋白激酶和糖原合成酶激酶的激活引起tau蛋白过度磷酸化，进而引起神经退行性疾病；Aβ不仅对神经细胞具有直接的毒性作用导致炎症反应，其本身也能产生自由基和反应性氧化物，通过损伤膜脂质导致神经退行性变[13-14]。大脑Aβ聚集反映血浆中Aβ生成增加，因此血浆中Aβ的浓度改变可以间接反映脑组织中Aβ的聚集情况[15]。麻醉药物丙泊酚的持续大剂量应用能够对动物的认知功能造成不良影响，甚至产生术后学习记忆能力的严重受损[16]。

本实验结果表明，多次重复腹腔注射高剂量(100 mg/kg)丙泊酚并维持麻醉后，老年SD大鼠的学习记忆及认知功能受损，高剂量组逃避潜伏期显著延长、穿越平台次数显著减少，海马区nNOS阳性细胞数和积分光密度值(IOD)明显低于训练组和低剂量组，血清β-淀粉样蛋白含量显著增多，这种损伤程度与丙泊酚的剂量相关。

[1]Johnson JT,Monk T,Rasmuseen LS,et al.Postoperative connitive dysfunction in middle-aged patients[J].Anesthesiology,2002,96(6): 217-224.

[2]赵丽滨,曹殿青.全身麻醉药对术后认知功能障碍的影响[J].医学综述,2010,16(21):3323-3326.

[3]施丽静,徐静,万燕杰.全身麻醉术后认知功能障碍与血小板β-淀粉样蛋白变化的关系[J].临床麻醉学杂志,2014,30(11):1091-1094.

[4]Pretico C,Quattrone D,Lucanto T,et al.Durgs of anesthesia acting on central cholinergic system may cause post-operative cognitive dysfunction and delirium[J].Med Hypothese,2005,65(5):972-982.

[5]何苗,罗燕,余布为.术后认知功能障碍与阿尔茨海默病的研究进展[J].上海医学,2014,37(10):893-896.

[6]Humpel C.Identifying and validating for biomarker for Alzheimer's disease[J].Trends Biotechnol,2011,29(1):26-32.

[7]Castellani RJ,Rolston RK,Smith MA.Alzheimer's disease DisMon, 2010,56(9):484-546.

[8]Leung LS,Shen B,Hippocam CA,et al.kindling but not long term poteniation disrupts spatial memory peromance[J].Learn Mem, 2006,13(1):18.

[9]Newman S,Stygall J,Hirani S,et al.Postoperative cognitive dysfunction after noncardiac surgery:a systematic revive[J].Anesthesiology, 2007,106(3):572-90.

[10]Xie Z,Dong Y,Maeda U,et al.The common inhalation anesthetic isoflurane induces apoptosis and increases Aβ levels[J].Anesthesiology,2006,4:988-994.

[11]Wei H,Xiong W,Yang S,et al.Propofol facilitates the development of long-term depression(LTD)and impairs the maintenance of long-term potentiation(LTP)in the CA1 region of the hippocampus of anesthertized rats[J].Neurosci Lett,2002,324(3):181-184.

[12]Townsend KP,Obregon A.Proinflammatory and vasoactive effects of A bête in the cerebrovasculature[J].Ann N Y Acad Sci,2002,977: 65-67.

[13]Jana A,Pahan K.Fibrillar amyloid-bete peptids kill human primary neurons via NADPH oxidase-mediatted activation of neutralsphinase. Implication for Alzheimer's disease[J].J Biol Chem,2004,279(49): 51451-51459.

[14]Keil U,Bonert A,Marques CA,et al.Amyloid bête-induced changes in nitric oxid production and mitochondrial activity lead to apoptosis [J].J Biol Chem,2004,279(48):50310-50320.

[15]Wiesmann M,Steinmeier E,Magerkurth O,et al Outcome prediction in traumatic brain injury:comparison of neurological status,CT findings,and blood levels of S100 β and GFAP[J].Acta Neurol Scand,2010,121(3):178-185.

[16]孟凡军,李燕,李刚,等.丙泊酚对大鼠空间学习、记忆及脑内nNOS表达的影响[J].基础医学与临床,2005,25(11):1063-1066.

Effects of propofol on cognitive function,hippocampus nNOS and serum amyloid β-protein in aged rats.

ZHANG Huan,YUAN Tao,SHI Yan-jie.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Liaoning Chinese Medicine Uiversity; Department of Anesthesiology,Third Affiliated Hospital of Shenyang Medical College,Shenyang 110032,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of propofol on learning and memory of elderly rats and its possible mechanism.MethodsThirty Sprague-Dawley(SD)rats(average age,12 months)were chosen and randomly assigned to one of three groups(n=10 for each group):training group,propofol low dose group and high dose group.24 hours after anesthesia,no fixed number of random training method was used for behavioral tests in the water maze for five days,and the escape latency and the number of across the platform were recorded.After behavioral tests were finished,the blood was drawn,after which the rats were immediately killed by decapitation.Then,the expression of nitric oxide synthase(nNOS)in the hippocampus area of brain tissue and the content of serum amyloid β-protein were detected by immunohistochemical staining method.ResultsThe behavioral tests in water maze showed that compared with training group,propofol high dose group had the significantly longer escape latency and significantly less number of across the platform(t=12.142,t=5.63,respectively,P＜0.01);There was no significant difference between the training group and propofol low dose group in the two same indexes(t=0.38 and 0.773,respectively,P＞0.05).According to the results of immunohistochemical staining,the nNOS positive cells in hippocampus and integral optical density(IOD)of propofol high dose group were significantly lower than those of the propofol low dose group and training group(t= 12.072,t=11.646,respectively,P＜0.01);There was no significant difference between the training group and propofol low dose group in the two same indexes(t=0.642,P＞0.05);Compared with propofol low dose group and training group, the amyloid β-protein content in propofol high dose group significantly increased(t=11.692 and 10.354,respectively P＜0.01);There was no significant difference between propofol low dose group and training group in the amyloid β-protein content(P＞0.05,t=0.082).ConclusionAnesthesia using multiple high dose injection of propofol can induce and maintain the damage on learning and memory function of elderly rats,which has the close relationship with the inhibition degree of hippocampus nNOS expression and the content of Serum amyloid β-protein.

Propofol;Aged rats;Cognitive function;Nitric oxide synthase(nNOS);Serum amyloid β-protein

R-332

A

1003—6350（2016）10—1554—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.002

2016-01-12)

辽宁省教育厅科研项目(编号：L2013378)

苑韬。E-mail：ytshy@sohu.com