顶空气相色谱法测定乳铁蛋白脂质体中乙醚和氯仿的残留量

丁枫芸　贾彦博　马洁清　赵　凯　肖海龙

(1.杭州市质量技术监督检测院，杭州 310019；2.杭州市食品药品检验研究院，杭州 310022)



顶空气相色谱法测定乳铁蛋白脂质体中乙醚和氯仿的残留量

丁枫芸1贾彦博2*马洁清1赵凯1肖海龙2

(1.杭州市质量技术监督检测院，杭州 310019；2.杭州市食品药品检验研究院，杭州 310022)

摘要：采用AgilentHP-5毛细管柱(30 m× 0.32mm，涂膜厚0.25μm )、氢火焰离子化检测器，采用程序升温，柱温起始温度为50℃，保持2 min，以10℃/min的升温速率升至100 ℃，保持5min；进样口与检测器温度均为250℃；顶空瓶平衡温度90℃，平衡时间30min。以二氯甲烷为内标物，直接进样测定乳铁蛋白脂质体中乙醚和三氯甲烷的残留量。结果表明各个峰的分离效果良好，乙醚浓度在9.98~149.5μg/mL的范围内呈良好线性关系(R2=0.9995)，三氯甲烷浓度在9.92~149.2μg/mL的范围内呈良好线性关系(R2=0.9994)，最低检测限分别为0.025μg/mL和0.15μg/mL，平均回收率在95.36%~100%之间 ，3批样品中有机溶剂乙醚和氯仿的残留量均符合规定。顶空气相法操作简便，准确可靠，可用于乳铁蛋白脂质体中乙醚和氯仿残留量的测定。

关键词：气相色谱法脂质体乙醚氯仿

纳米脂质体是极具开发潜力的纳米载体系统之一，被广泛应用于食品和药物等领域[1-3]，磷脂本身是细胞膜成分，进入人体内不会引起免疫反应[4]。制备得到的乳铁蛋白脂质体可以有效的提高其在体内的半衰期，提高机体的免疫功能与药物产生协同效应，同时脂0质体的膜结构进入体内不会引起免疫反应[5]。但是，脂质体的制备时用到的膜材磷脂和胆固醇是溶于乙醚和氯仿中，而乙醚和氯仿属于有毒试剂。因此需要确保有机溶剂的残留量低于国家标准的0.006%[5]，从而保证脂质体的安全性。目前，关于脂质体中乙醇和氯仿残留量的检测方法已有报道[6-8]，但是关于乙醚和氯仿的至今未见报道。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

乳铁蛋白脂质体(自制)；三氯甲烷(分析纯)和乙醚(分析纯)购自杭州嘉辰化工有限公司；

Agilent 7890型气相色谱仪，Agilent G1888顶空进样系统(美国Agilent 公司)，氢火焰离子化检测器( FID)； 高纯氢气( 99. 99%)； 高纯氮气( 99. 99%)； 钢瓶空气。

1.2溶液的配制

1.2.1内标储备液的配制

精密称取二氯甲烷50mg置于50mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度。

1.2.2对照品溶液的配制

精密移取乙醚50mg、三氯甲烷50mg，分别置于50mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀，即为对照品储备液。分别取上述对照品储备液5mL和内标储备液5mL，置于50mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液。精密量取对照品溶液5mL置于20mL顶空瓶中，密封，摇匀。

1.2.3样品溶液的制备

量取乳铁蛋白脂质体5mL和5mL内标储备液5mL，置于50mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀。精密量取样品溶液5mL置于20mL顶空瓶中，密封，摇匀。

1.3色谱条件

色 谱 柱 ：Agilent 毛 细 管 柱(30m×0.32mm，涂膜厚0.25μm)；柱流速为1.2mL/min；

载气：氮气，分流比：30∶1 ；程序升温：柱温起始温度为50℃，保持2 min，以10℃/min的升温速率升至100 ℃，保持5min；进样口温度250℃； 检测器温度250 ℃；顶空瓶平衡温度90℃ ，平衡时间30min。

1.4线性关系考察

分别精密量取对照品储备液0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、7.5mL，置于50mL容量瓶中，每个容量瓶分别加入5mL内标储备液，加超纯水稀释至刻度。分别进样5mL，记录色谱图，以待测物的峰面积与内标峰面积的比值对对照品溶液的浓度进行线性回归。

1.5检测限与定量限的确定

采用逐步稀释法，以信噪比S/N=3 计，计算各待测组分(乙醚及三氯甲烷)的检测限；以信噪比S/N=10计，计算各待测组分的定量限。

1.6方法精密性验证

取对照品溶液，连续进样5次，密封进样，记录色谱图，按内标法计算待测组分的平均浓度和RSD值。

1.7回收率实验

采用加样回收率测定方法，按高、中、低浓度法分别精密吸取一定量的乙醚和三氯甲烷对照品溶液，加入已知乙醚和三氯甲烷残留量的乳铁蛋白脂质体液中，密封进样，记录色谱图，按内标法计算回收率及RSD值。

1.8样品的测定

取同个批号的脂质体，按照1.2.3的方法制成样品溶液，密封进样，记录色谱图，同法测定样品溶液以待测物与内标峰面积比计算样品中有机溶剂的残留量。

2结果

2.1保留时间的确定

量取对照品溶液5mL，按色谱条件进样检测，色谱图如1所示。

图1　乙醚、二氯甲烷和三氯甲烷的色谱分离图

由图1可看出，乙醚、二氯甲烷和三氯甲烷的分离度良好，保留时间分别为2.427min、2.506和2.851min。

2.2方法的线性关系

对照品色谱峰面积与内标峰面积的比值(y)与对照品溶液的浓度(x)呈良好的线性关系，见表1。

表1　回归方程和线性范围(n=7)

2.3方法的检测限与定量限

通过逐级降低浓度，进样测定，确定检测限，性噪比=3，乙醚和三氯甲烷的检测限分别为0.025μg/mL和0.15μg/mL。定量限以性噪比=10，乙醚和三氯甲烷的定量限为0.08μg/mL和0.5μg/mL。

2.4方法的精密性

对照品连续进样5次，进样量为5mL，测得乙醚与三氯甲烷和二氯甲烷的峰面积比的RSD分别为4.677%、2.257%，所得被测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差(RSD)小于5%。结果表明，该方法的精密度良好。

2.5回收率实验

采用加样回收率测定方法，按高、中、低浓度分别精密量取一定量的对照品储备液加入到已知乙醚和三氯甲烷残留的5mL乳铁蛋白脂质体中，按“样品溶液的制备”方法处理，分别进样3次，结果见表2。

表2　回收率实验结果(n=9)

由表2可知，乙醚和三氯甲烷的平均回收率在95.36%~100%之间，RSD值在0.47%~4.69%之间，结果表明该方法准确可靠。

2.6样品的测定

精密吸取3个不同批次的乳铁蛋白脂质体样品，得到3个脂质体样品溶液，每个样品测3次，进样量5mL，测定峰面积，根据回归方程计算含量，结果见表3。

表3　样品含量测定结果　%

3讨论

实验结果表明，本方法灵敏度高、色谱分离度好，且重现性、回收率好，操作简便，可用于乳铁蛋白脂质体口服液中氯仿和乙醚残留量的测定。待测样品经检测后氯仿和乙醚的残留量低于0.006%。线性实验中，乙醚和氯仿的相关系数大于规定的0.999，从而可看出本实验的线性关系良好，同时，在加样回收率的实验中，被检测物质的平均回收率在95.36%~100%之间，符合要求。以上结果表明，乳铁蛋白脂质体中有机溶剂残留量的分析方法具有可行性，能有效的控制乳铁蛋白脂质体中乙醚和氯仿的残留限量。

参考文献

[1] Fathi M， Mozafari M R， Mohebbi M. Nanoencapsulation of food ingredients using lipid based delivery systems[J]. Trends in Food Science & Technology，2012，23：13-27.

[2] Sharma Amarnath， Sharma Uma S. Liposomes in drug delivery: progress and limitations[J]. International Journal of Pharmaceutics.1997，154 ： 123-140.

[3] Pinto-Alphandary Huguette， Andremont Antoine， Couvreur Patrick. A Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications[J].International Journal of Antimicrobial Agents, 2000，13： 155 - 168.

[4] 张必芳.番茄红素纳米脂质体的制备及其体内吸收、抗氧化的研究[D].合肥工业大学,2009.

[5] 国家药典委员会. 中国药典二部[ M]. 北京: 化学工业出版社，2005Ⅷ: 附录54-57.

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[8] 官东秀，冯祚臻，邓莲芬，等.气相色谱法测定冬虫夏草多糖脂质体口服液中氯仿残留量[J]. 中国医院药学杂志，2005，25(2 )144-145.

Residues determination of ether and chloroform in lactoferrin lipid by headspace gas chromatography.DingFengyun1，JiaYanbo2*，MaJieqing1，ZhaoKai1，XiaoHailong2

(1.HangzhouInstituteofCalibrationandTestingforQualityandTechnicalSupervision，Hangzhou，Zhejiang310019,China;2.HangzhouInstituteforFoodandDrugControl，Hangzhou，Zhejiang310022,China)

Abstract:The detector was FID， and CH2Cl2was used as internal standard substance. The column was AgilentHP-5 capillary column(30 m×0.32 mm , 0.25μm). The column temperature was programmed as follows: initial column temperature was 50℃, maintained for 2 min. The temperature was then increased by 10℃/min to 100℃, held for 5min. The injector temperature was 250℃, and the detector temperature was 250℃.The equilibration temperature of headspace vial was 90℃, the equilibrium time was 30min.The results showed that two residual solvents, namely ether and chloroform were completely separated. Ether concentration showed a good linearity in the range of 9.98-149.5μg/mL (R2=0.9995), chloroform concentration showed a good linearity in the range of 9.92-149.2μg/mL (R2=0.9994).The detection limits were 0.025μg/mL and 0.15μg/mL. The average recovery rate was between 95.36% and 100%. The residues of ether and chloroform in three samples were in accordance with the provisions . The method can be used for analysis of ether and chloroform residues in lactoferrin.

Key words:gas chromatography；ether；chloroform；lactoferrin

收稿日期：2015-06-16

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2016.01.006

作者简介：丁枫芸，女，1987出生，助理工程师，主要从事食品安全检测分析。* 通讯作者：贾彦博，女，1979出生，博士，高级工程师，主要从事食品及农产品质量安全等方面的研究工作，E-mail：jiaboshi2002@126.com。

基金项目：浙江省重大科技专项(乳制品中重要风险因子检测及安全评价研究2012C12013-1)