高效液相色谱法测定苹果酸中的其它有机酸

段先哲　李　南*　谭凯旋　谢焱石　胡　杨　陈　亮　韩世礼　冯志刚　马　强　刘　珊

(1. 南华大学，衡阳421001；2. 湖南省核燃料循环技术与装备协同创新中心，衡阳4210001)



仪器应用

高效液相色谱法测定苹果酸中的其它有机酸

段先哲1,2李南1,2*谭凯旋1谢焱石1胡杨1陈亮1韩世礼1冯志刚1马强1刘珊1

(1. 南华大学，衡阳421001；2. 湖南省核燃料循环技术与装备协同创新中心，衡阳4210001)

摘要：建立了测定苹果酸中的马来酸与富马酸的高效液相色谱检测方法。色谱柱为磺酸基Carbomix H-NP (7.8×300mm；10μm)，流动相为0.002mol/L H2SO4，流速为0.5mL/min，进样量为50μL，检测波长为210nm，柱温为55℃。系统适用性实验中苹果酸的理论塔板数大于5000，马来酸与富马酸分别与相邻的峰分离度大于1.9，说明此方法检测苹果酸中的马来酸和富马酸灵敏度高，分离度良好。重复性实验中6份供试溶液中富马酸和马来酸含量的相对标准偏差小于3%，方法精密度良好。3种水平浓度下的加标实验中，马来酸和富马酸平均回收率都在90%～120%之间，相对标准偏差均小于4%，方法准确度良好。该方法可作为苹果酸中的马来酸与富马酸的定量分析方法。

关键词：苹果酸马来酸富马酸高效液相色谱

苹果酸，又名2-羟基丁二酸，它是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，广泛应用于食品和医药行业等。在食品行业中，L-苹果酸是国际上公认的一种安全性食品添加剂,也是一种优良的调酸剂和保鲜剂[1]。在医药行业，苹果酸作为一种药物成分，常用于药物制剂、片剂、糖浆和氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率以及治疗肝病、贫血、免疫力低下等多种疾病，所以需要严格控制苹果酸生产过程中所带来的杂质(如马来酸和富马酸等)。因此，对苹果酸及其中的马来酸与富马酸的测定方法的研究具有重大意义。目前国内有对苹果酸含量测定的方法有酶法[2]、生物传感器法[3]、双波长分光光度法[4]、离子色谱法[5-7]、气相色谱法[8，9]、毛细管电泳法[10-11]和高效液相色谱法[12-16]等。本实验建立了测定苹果酸中的马来酸与富马酸的高效液相色谱检测方法，采用磺酸基阳离子交换色谱柱，具有更高的分离度和检测灵敏度。

1实验部分

1.1试剂与仪器

苹果酸(中照力德化工有限公司)；富马酸标准品(中国食品药品检定研究所)；马来酸标准品(中国药品生物制品检定所)；硫酸，分析纯；

岛津HPLC-20A；CPA225D型电子天平(赛多利斯)。

1.2色谱条件

色谱柱为磺酸基Carbomix H-NP (7.8×300mm；10μm)，流动相为0.002mol/L H2SO4，流速为0.5mL/min ，进样量为50μL，检测波长为210nm，柱温为55℃。

1.3实验方法

精密称取马来酸和富马酸标准品，加流动相分别配置2μg/mL马来酸和5μg/mL富马酸，分别作为马来酸和富马酸的标准储备液。取上述标准储备液1mL加流动相稀释到10mL，即得马来酸和富马酸混合对照溶液，其中杂质含量均用外标法计算。

2结果与讨论

2.1色谱柱的选择

本实验采用磺酸基色谱柱。常用的硅胶柱分析有机酸时流动相为水溶液，无有机相，且其pH值低于或接近色谱柱耐受极限，长时间用此极限的流动相条件会极大降低色谱柱柱效及其使用寿命[13]，而磺酸基色谱柱更适用于较低的pH值和无有机相的水溶液流动相，具有更高的分离度和检测灵敏度。

2.2检测波长的选择

用紫外分光光度计分别对苹果酸、马来酸和富马酸溶液进行扫描，得出苹果酸在210nm处有最强的紫外吸收，马来酸和富马酸在210 nm处检测有很高的灵敏度，所以检测波长选择为210nm。

2.3系统适用性

称取L-苹果酸用品约30mg，量取混合对照溶液3mL置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，即为系统适用性溶液。在上述色谱条件下进行测定，结果见表1。结果表明，苹果酸的理论塔板数大于5000，苹果酸、马来酸与富马酸分别与相邻的峰分离度大于1.9，说明此方法检测苹果酸中的马来酸和富马酸具有较高的灵敏度和良好的分离度。

表1　方法的系统适用性实验

2.4重复性实验

配置0.1mg/mL苹果酸样品溶液6份，分别在上述色谱条件下进行测定，按外标法计算，结果见表2。结果表明，6份供试液中富马酸和马来酸含量的相对标准偏差小于3%，方法精密度良好。

表2　重复性实验测定结果

2.5加标回收率实验

在苹果酸样品中分别加入3种不同浓度的马来酸和富马酸标准溶液，每种浓度水平的溶液平行配置3份，分别在上述色谱条件下进行测定，按外标法计算回收率，结果见表3。结果显示，3种水平浓度下的加标实验中，马来酸和富马酸平均回收率都在90%～120%之间，相对标准偏差均小于4%，方法准确度良好。

表3　方法的回收率

3结论

本实验建立了一种简单有效的测定苹果酸中的马来酸与富马酸的检测方法。结果表明，系统适用性实验说明此方法检测苹果酸中的马来酸和富马酸灵敏度较高，分离度良好。重复性实验中，马来酸和富马酸含量的相对标准偏差小于3%，方法精密度良好。3种水平浓度下的加标实验中，马来酸和富马酸平均回收率都在90%～120%之间，相对标准偏差均小于4%。因此，该方法简便、快速、有效、灵敏、准确、具有良好的精密度和准确度，可作为苹果酸中马来酸和富马酸的定量分析方法。

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Determination of other organic acids in malic acid by high performance liquid chromatography.DuanXianzhe1,2，LiNan1,2*，TanKaixuan1，XieYanshi1，HuYang1，ChenLiang1，HanShili1,FengZhigang1，MaQiang1，LiuShan1

(1.UniversityofSouthChina，Hengyang421001，China; 2.HunanProvinceCooperativeInnovationCenterforNuclearFuelCycleTechnologyandEquipment，Hengyang421001，China)

Abstract:Chromatographic column was Carbomix H-NP (7.8×300mm，10μm); the mobie phase was 0.002mol/L H2SO4; the flow rate was 0.5mL/min.; the injection volume was 50μL; the detection wavelength was 210nm，and the column temperature was 55℃. In the system suitability experiment，the theoretical plate number of malic acid was more than 5000，the resolution of maleic and fumaric acids were greater than 1.9，indicating that this method had a high sensitivity and good resolution for detection of maleic and fumaric acids in malic acid. In the repeated experiment，the relative standard deviation of the concentrations of fumaric and maleic acids in 6 repeated samples was less than 3%，showing a satisfactory precision of this method. In the spiked experiment of three levels，the average recovery of maleic and fumaric acids was between 90% and 120%，all the relative standard deviations were less than 4%，demonstrating that this method was considerably accurate. This method can be used for quantitative determination of maleic and fumaric acids in the malic acid.

Key words:malic acid; maleic acid; fumaric acid; high performance liquid of chromatography (HPLC)

收稿日期：2015-09-14

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2016.01.004

作者简介：段先哲，男，1985出生，博士，主要从事地球化学、仪器分析及相关研究工作。*通讯作者：李南，女，1985出生，硕士，主要从事分析化学、仪器分析及相关研究工作，Email：linan19851018@163.com。

基金项目：国家自然科学基金(41503016)；湖南省教育厅优秀青年项目(15B201)；中国博士后科学基金(2015M582334)；国防基础科研计划项目(B3720110004)；南华大学博士启动基金(2014XQD08)；南华大学“蒸湘学者计划”。